固态核磁共振技术在脂质立方相膜蛋白研究中的突破与应用

《Biophysical Journal》：Solid-State NMR of Membrane Peptides and Proteins in the Lipid Cubic Phase

研究人员为解决膜蛋白固态核磁共振（ssNMR）样本制备难题，以脂质立方相（LCP）为介质开展研究，发现 LCP 可用于收集膜蛋白和肽的 NMR 光谱，为药物研发提供便利。

　　膜蛋白在细胞中承担着众多关键功能，是备受瞩目的药物靶点。然而，长期以来，针对膜蛋白的结构研究困难重重。传统的基于大分子 X 射线晶体学（MX）的药物设计，虽在一定程度上推动了相关领域的发展，但 MX 技术在膜蛋白晶体培养方面面临巨大挑战，而且还可能出现 “晶格暴政” 现象，导致获取的蛋白质构象不自然。

与此同时，固态核磁共振（ssNMR）技术为研究膜蛋白提供了新的契机。它能在接近天然膜的环境中研究膜蛋白，不仅能提供原子分辨率的局部结构信息，还能揭示蛋白动态，更全面地洞察其生理功能。但 ssNMR 研究的关键在于样本制备，目前制备用于 ssNMR 的蛋白负载膜样本颇具难度，急需更便捷的膜模拟系统。

来自爱尔兰三一学院（Trinity College Dublin）等多个机构的研究人员，针对这一困境展开了深入研究。他们聚焦脂质立方相（LCP），探索其作为 ssNMR 替代介质的可行性。研究人员选用了短杆菌肽（gramicidin）和细菌脂蛋白信号肽酶 II（LspA）这两种膜蛋白，通过一系列实验，成功获得了它们在 LCP 中的 ssNMR 光谱，并优化了光谱质量的相关参数。

此次研究成果发表在《Biophysical Journal》上，意义重大。它为膜蛋白的研究开辟了新途径，有助于推动基于膜蛋白结构的药物开发，使科研人员能更深入地了解膜蛋白的功能机制，为攻克相关疾病提供了有力的理论支持。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：固态核磁共振（ssNMR）技术，用于收集膜蛋白和肽在 LCP 中的 NMR 光谱；溶液核磁共振（Solution NMR）技术，研究抗生素球霉素（globomycin）对 LspA 结构和动力学的影响；荧光共振能量转移（FRET）技术，监测 LspA 的酶活性；在 meso 结晶技术，获取膜蛋白晶体用于结构测定；X 射线衍射技术，解析膜蛋白的晶体结构。

下面介绍研究结果：

1. 固态核磁共振技术对短杆菌肽的研究：研究人员制备了高浓度的短杆菌肽 - LCP 样本，其肽与脂质的摩尔比达到 1:20，这是 LCP 对短杆菌肽承载量的上限。通过 1D 1H光谱和 13C CP-MAS 光谱，成功检测到短杆菌肽的共振信号。降低温度和提高魔角旋转（MAS）频率，能显著提升光谱的信噪比（SNR）和分辨率。例如，在 0°C 时，短杆菌肽 13C 共振信号的 SNR 相较于 20°C 时提高了 5 - 7 倍。
2. 固态核磁共振技术对 LspA - 球霉素复合物的研究：研究人员对 13C/15N 标记的 LspA 与球霉素的复合物进行研究。通过 1D 15N 和 13C CP-MAS 光谱，检测到 LspA 的共振信号。同样，降低温度和提高 MAS 频率可改善光谱质量，在 0°C 和 14.5 kHz MAS 条件下，LspA 的 13C 光谱在羰基区域的 SNR 提高了约 20 倍。
3. LspA 与 LCP 中脂质和水成分的相互作用研究：研究人员通过饱和转移差异实验，发现 LspA 与单油酰甘油（monoolein）和水均有直接相互作用，且其与脂质和水成分的相互作用未受蛋白质聚集等因素的显著影响。双 CP 实验也证明了在 LCP 样本中进行复杂多 CP 实验以确定 ssNMR 归属和结构的可行性。
4. 溶液核磁共振技术对 LspA 的研究：研究人员通过溶液 1H?15N HSQC 和 TROSY 光谱研究球霉素对 LspA 结构的影响。结果显示，球霉素与 LspA 结合后，光谱发生显著变化，如交叉峰数量增加、化学位移分散度增大，表明 LspA 的结构变得更加有序。

研究结论和讨论部分指出，脂质立方相作为一种膜模拟物，在膜蛋白的 ssNMR 研究中具有重要价值。它能够实现膜蛋白和肽在双层膜中的高浓度均匀重构，样本温度和 MAS 频率是优化 ssNMR 测量的关键变量。ssNMR 光谱在短杆菌肽和 LspA 研究中的表现，与在平面脂质双层中的结果相当，表明在 meso ssNMR 是研究单跨膜螺旋蛋白和肽的便捷方法。此外，结合溶液 NMR 和结晶学方法，对同一膜蛋白靶点进行研究，将为深入了解膜蛋白结构和功能提供更全面的视角。研究还发现，LspA 与球霉素结合后，其结构和动力学发生显著变化，这与之前的研究结果一致，进一步证实了 LspA 作为抗生素开发靶点的潜力。总之，该研究为膜蛋白的研究提供了新的策略和方法，推动了相关领域的发展，有望为新药研发带来新的突破。