用于生物分子快速分离检测的多通道声学分离器：创新突破与应用前景

《Device》：Siphon-based multichannel acoustofluidic separator for rapid and multiplexed biomolecule detection

本文介绍了多通道声学分离器及功能负声学对比粒子（fNACPs），可简化生物分子检测流程，加速检测。

　　### 用于生物分子快速分离检测的多通道声学分离器：创新突破与应用前景
在生命科学和健康医学领域，生物分子（如蛋白质、核酸等）的精准检测意义重大，广泛应用于个人医疗保健、公共卫生监测以及环境监测等方面。然而，从复杂流体中检测特定生物分子时，往往需要先将其从污染物中纯化出来，这一过程通常涉及繁琐的样本预处理和复杂的工作流程。

传统的生物传感策略在捕获、分离和制备生物分子以进行特异性高灵敏度检测时，面临诸多挑战。常用的酶联免疫吸附测定（ELISA）等定量生物分子检测方法，不仅需要大量人工操作、处理时间长，而且工作流程复杂。此外，从异质性样本（如全血或其他含有大量非靶分子、细胞或污染物的流体）中纯化目标生物分子也颇具难度，许多检测方法都需要进行大量样本预处理。

近年来，声学流体系统作为一种新兴技术，利用超声波在小体积流体中操控粒子和细胞，已被用于分离生物靶标，包括循环肿瘤细胞、蛋白质和外泌体等。但现有的声学流体系统大多存在无法在高流速下实现分离（如≥0.5 mL min^?1）、需要机械泵驱动流体等问题，限制了其广泛应用。

在此背景下，本文介绍了一种多通道声学分离器装置和一类生物特异性且声学响应的微粒子 —— 功能负声学对比粒子（fNACPs），旨在实现从复杂样本中快速、简便且高通量地纯化生物分子，用于下游检测。

多通道声学分离器的工作原理

多通道声学分离器通过虹吸驱动，设有 12 个声学捕获通道，可在 5 分钟内并行分离、洗涤和收集 12 个样本。该装置利用虹吸效应驱动流体，无需自动化泵或柱塞，简化了工作流程。每个通道都支持横向半波长体声波驻波，在通道中心产生压力节点，沿通道壁产生压力波腹。fNACPs 能特异性地从异质流体样本（如全血）中捕获生物分子靶标。捕获后，fNACPs 样本通过装置的捕获通道，由于其负声学对比度，会强烈固定在通道壁上，而其他物体（如红细胞和白细胞）则聚焦到通道中心并作为废液排出。洗涤 fNACPs 后，关闭声学功能，即可将纯化的 fNACPs 收集到 96 孔板中，随后对 fNACPs 表面的生物分子进行荧光标记，通过荧光测量实现下游生物分子定量分析。

3D 打印的多通道声学分离器实现声学捕获

为了使多通道声学分离器易于集成到现有实验室工作流程中，研究人员设计了与 96 孔板和 12 通道多通道移液器兼容的装置，可同时处理 12 个样本。分离器主体由 5 个主要打印部件组成，包括上虹吸室阵列、捕获通道阵列支架、左右框架和电气端口盖。捕获阵列由 12 个方形玻璃毛细管组成，内径为 1×1 mm，长约 25 mm，均固定在一个大型矩形压电换能器上，其共振频率约为 750 kHz。两个 3D 打印的换能器夹在使用过程中固定换能器。

当液体样本存在于分离器通道中时，施加约 750 kHz 的交流电（AC）正弦波驱动压电换能器，会在每个通道内建立半波长驻波压力波。这样，小于声波波长的物体就会受到声辐射力的作用。初级声辐射力的轴向分量（垂直于通道长度方向）会将物体推向通道中心线的节点或驻波的波腹（位于通道壁处），具体方向取决于物体的声学对比度因子。大多数细胞和商业聚合物颗粒在水中或血液中悬浮时表现出正声学对比度，而研究人员设计的 fNACPs 由弹性聚合物制成，具有很强的负声学对比度。此外，驻波还会在横向方向（平行于通道长度方向）施加初级声辐射力，以及在小距离内粒子之间产生吸引力的次级声辐射力。这些力使得 fNACPs 能够在高流速下被强烈捕获在通道壁上，同时血液成分被冲洗出通道。

虹吸驱动的流体操作

为了避免使用泵驱动流体通过捕获通道，多通道声学分离器采用虹吸驱动流体。研究人员设计了包含 12 个 3D 打印室的上虹吸室阵列，可容纳约 1,200 μL 液体。连接到每个毛细管顶部的硅胶管延伸到虹吸阵列的边缘并向下进入虹吸室底部，通过压力配合固定。

为每个通道启动虹吸时，需向虹吸室添加约 600 μL 液体（通常为含 0.05 vol% 吐温 20 的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤缓冲液）。手动按压硅胶管，使液体从虹吸室经过管道最高点进入玻璃毛细管，随后液体通过虹吸效应排出，从毛细管尖端以离散液滴的形式流出。液滴形成主要由上虹吸室中液体产生的静水压力驱动，当液滴重力超过表面张力时，液滴脱离毛细管。

与大型虹吸不同，该装置的微型虹吸在虹吸停止点高于入口时，不会完全排空虹吸室，避免了虹吸中断后需重新启动的问题。通过调整通道出口相对于通道入口的高度（ΔH），可以平衡拉普拉斯压力和上虹吸室中的静水压力，在液体到达入口高度之前停止流体流动，类似于毛细管压力控制阀的原理。为了最小化虹吸停止点保留的液体体积，上虹吸室设计为向底部的管道入口逐渐变细。

基于虹吸的流动用于清洗通道中的血液

为了评估装置从全血中纯化 NACPs 的能力，研究人员调整 ΔH，使血液存在于装置中且通道启动时，平衡液位最小化（即低于室的倾斜部分但高于通道入口）。向 12 个上虹吸室添加 300 μL 3 倍稀释的猪血，待通道达到平衡后，通过向虹吸室重复添加洗涤缓冲液来清洗通道，并收集通道出口流出的液体。稀释收集的样本后，测量其在 542 nm 处的吸光度（该吸光度是全血的特征）。结果发现，经过 4 次洗涤后，通道内残留的血液成分显著减少，收集的液体吸光度仅为第二次洗涤后收集液体吸光度的 3.2% ± 0.3%，而缓冲液对照的吸光度为 2.1% ± 0.3%。因此，在后续研究中，收集 fNACPs 前均对通道进行 4 次洗涤。

基于虹吸的流动用于处理不同类型的流体

血液和缓冲液在表面张力和粘度上存在差异，这会影响虹吸驱动的流动行为。研究人员手动调整 ΔH，使水、缓冲液和血液在所有虹吸室中的流体平衡高度最小化。由于水的表面张力大于血液（约 71 mN m^?1 vs. 约 51 mN m^?1），水样本在出口处的拉普拉斯压力更大，导致在更大的 ΔH 值（水和缓冲液约为 14 mm，血液约为 11 mm）下实现流体平衡高度最小化。

研究人员通过捕获视频分析了三种流体的虹吸排水情况，发现水的虹吸排水速度比缓冲液和血液更快（水约 17 s，缓冲液约 26 s，血液约 79 s）。此外，该装置中水流的最大流速为 1.6 mL min^?1，缓冲液为 1.3 mL min^?1，血液为 0.9 mL min^?1，这些流速均在能有效捕获 NACPs 的预期范围内。

NACP 在多通道声学分离器中的捕获

研究人员按照先前描述的协议制备了低尺寸多分散性的 NACPs。通过将聚二甲基硅氧烷（PDMS）前体与 0.1% v/w 三乙氧基乙烯基硅烷（TEOVS）在含有 1.0% Pluronic F-108 表面活性剂的水中均质化，固化后过滤混合物，得到平均直径为 23.0 μm、变异系数为 11.8% 的 NACPs。

为了评估分离器装置中 NACPs 与正声学对比粒子（PACPs）的分离效果，研究人员将涂有荧光蛋白的 NACPs 与作为 PACPs 模型的 5.1 μm 荧光聚苯乙烯（PS）粒子混合，通过荧光显微镜观察发现，施加声学作用后，NACPs 迅速被捕获在通道壁上，而 PS PACPs 则继续通过通道未被捕获。

在定量评估 NACPs 的捕获效率时，研究人员分别研究了 NACPs 从水和血液中的捕获情况。在生物分子检测实验中，fNACPs 在声学功能关闭后，通过添加 300 μL 洗涤缓冲液进行收集。研究发现，NACPs 从水和血液样本中的有效回收率均超过 90%，且大部分粒子损失发生在初始添加样本步骤，推测这是由于此时通道中没有已捕获的 NACPs，初始粒子不易受到二次声辐射力的吸引。通过显微镜分析样本纯化前后的情况，发现该纯化方法能有效去除样本中的绝大多数污染物（如红细胞和白细胞）。

应用展示

• fNACP 功能化实现可调生物标志物特异性：在临床环境中，检测和计数多种抗体及抗体同种型有助于评估患者的感染疾病状态和免疫反应。传统检测方法（如 ELISA）通常不适合快速、多重检测，而本文创建的 fNACPs 通过独特的功能化设计，可开发用于多重检测的 fNACP 检测方法，并使用常见的实验室荧光检测方法进行定量分析。

研究人员通过将 NACPs 依次与生物素 - 聚乙二醇（PEG） - 硅烷（BPS）、链霉亲和素（SA）以及各种生物素化的生物识别元件（BREs）孵育，并在每次孵育之间进行洗涤步骤，制备了 fNACPs。PEG 链提供抗污性能，SA 的 4 个生物素结合位点允许通过连接不同的生物素化 BREs 来调节 fNACP 的特异性。在本研究中，研究人员功能化 fNACPs 以捕获抗卵清蛋白 IgG（anti-OVA）、IgM 和 IgA 三种不同生物分子，并使用红色荧光的抗 IgG、抗 IgM 和抗 IgA 二抗进行检测。同时，制备了用生物素化牛血清白蛋白（BSA）修饰的对照 NACPs，用于揭示检测误差。

为了区分不同类型的 fNACPs 和对照 NACPs，研究人员在 SA 孵育步骤中使用不同比例的蓝色荧光 SA 和非荧光 SA 对 NACPs 进行功能化，实现了粒子的荧光条形码标记，便于通过流式细胞术进行区分和分析。

• fNACP 检测在大动态范围内的性能：为了评估三种 fNACP 检测方法的灵敏度，研究人员将 10⁴个针对 anti-OVA、IgM 或 IgA 的 fNACPs 和 10⁴个对照 NACPs 与含有不同浓度（从亚皮摩尔到微摩尔）的 anti-OVA、IgM 或 IgA 的 100 μL PBS 混合。孵育 30 分钟后，洗涤粒子并在 10 μg mL^?1的标记溶液中再次孵育 30 分钟，然后通过流式细胞术分析粒子荧光。

结果显示，三种检测方法的标准曲线均呈现随着生物分子浓度增加荧光强度对数增加的趋势。虽然对照 NACPs 的荧光强度也随生物分子浓度增加而有所升高，但与 fNACPs 相比，其荧光强度低多个数量级，表明检测功能正常。通过拟合 5 参数逻辑（5PL）曲线确定检测限（LOD），anti-OVA、IgM 和 IgA 检测方法的 LOD 分别为 0.02 nM、3.0 pM 和～0.25 pM，这些灵敏度与商业 ELISA 检测方法相当，凸显了该检测方法在实验室工作流程中的应用潜力。

• 条形码 fNACPs 用于多重生物标志物检测：为了评估 fNACP 检测的多重检测性能，研究人员将每种 fNACP 类型（用于捕获 anti-OVA、IgM 或 IgA）和对照 NACPs 各 10⁴个混合，并与含有不同组合的 0 或 10 nM anti-OVA、0 或 0.2 nM IgM 和 0 或 3.2 nM IgA 的 PBS 孵育。

荧光分析结果表明，只有在相应生物分子存在时，各粒子类型才会出现预期的荧光增强，这表明生物分子的捕获和检测具有特异性，检测组件之间不会发生影响多重检测的交叉反应。通过荧光显微镜分析进一步证实，当所有生物标志物都存在时，对照粒子不会显示来自二抗的红色荧光，而三种 fNACP 类型均会显示红色荧光，证明了基于 fNACP 的多重检测方法的可行性，可显著缩短实验室生物分子检测的时间。

• 多通道声学分离器简化复杂生物流体中的检测：为了评估 fNACP 检测与多通道声学分离器在从全血中检测生物分子的集成效果，研究人员进行了检测 IgA 的实验。将 10⁴个 IgA 特异性 fNACPs 和 10⁴个对照 NACPs 与含有不同浓度（0 - 32 nM）IgA 的 100 μL 猪血在 96 孔板中孵育 30 分钟，然后用多通道声学分离器对 fNACPs 和对照 NACPs 进行捕获和纯化，再在标记溶液中孵育 30 分钟，洗涤三次后通过流式细胞术分析粒子荧光。

整个检测过程耗时 70 分钟，大部分时间用于两次 30 分钟的孵育步骤。研究人员预计通过优化实验方案或使用更高亲和力的 BREs 和标记物，可缩短孵育时间。该检测在全血中的检测限从缓冲液中的～0.25 pM 增加到～1.6 pM，但仍与市售 ELISA 试剂盒（如 LOD 约为 3 pM）相当，证明了 fNACP 检测和多通道声学分离器能够从含有大量非靶分子和颗粒的复杂样本中检测低浓度生物分子。

结论与展望

本文介绍的多通道声学分离器是首个使用虹吸式流动的声学流体装置，是目前最简单的声学流体技术之一。该装置设计用于集成到现有检测工作流程中，可与常见实验室设备（如 96 孔板和多通道移液器）配合使用。若集成电源驱动捕获阵列的压电换能器，该装置可实现便携式现场生物分子纯化。

虽然本文展示了该系统在血清蛋白生物分子检测中的应用，但 fNACPs 和多通道分离器的应用不限于此。通过扩展 fNACP 功能化方案，使用不同的生物识别元件调整 fNACP 特异性，该系统可用于从各种流体样本中快速分离稀有细胞、小分子、核酸或其他物体，应用于细胞去杂和分离、废水分析、免疫沉淀和洗脱或通过阴性选择进行样本净化等领域。

此外，条形码方法可进一步扩展，以创建用于在单个测试中检测更多目标的多重检测方法。对多通道声学分离器的进一步调整，有望实现更广泛的流速范围、缩短纯化时间或通过多种场类型进行分离（如添加磁性附件）。但这些改进需要对装置中虹吸流动的基本物理原理进行严格评估。

总之，该研究成果为生物分子检测领域带来了新的技术和方法，具有广阔的应用前景和研究价值，有望在未来推动生命科学和健康医学领域的发展。