改进型 FLARE 系统 cytoFLARE：果蝇神经元活动研究的新利器

《Cell Reports Methods》：An improved FLARE system for recording and manipulating neuronal activity

cytoFLARE（胞质表达型 FLARE）可标记和操控果蝇幼虫神经元活动，助力神经科学研究。

　　

研究背景

在神经科学领域，记录和操纵特定行为背后的神经元群体是一项极具挑战性的任务。在行为过程的特定时间窗口内，只有部分神经元群体被激活。例如，动物在体验新环境时，海马体 CA1 区的一部分细胞会被激活，当动物回到相同环境时，同一部分神经元会再次被激活，而在不同的新环境中则不会。标记和操纵这些神经元群体对于研究认知和行为的机制至关重要。

为了识别这些被激活的神经元，科研人员开发了多种基于神经元活动的基因编码工具。在记录神经元活动的工具中，实时成像技术能够以亚秒级的精度监测动态钙水平和电压变化，但该技术在深部组织中的视野较小，且无法基于检测到的活动对神经元群体进行进一步表征，包括操纵它们的活动以研究其在行为中的作用。

基于即刻早期基因（IEG）的方法，如 c-Fos、Arc 及其衍生物的神经元活动依赖性表达，为解决实时成像的局限性提供了一种途径。时间门控的 IEG 系统，如 TRAP、TetTag 和 CANE，可在特定时间窗口内标记活跃的神经元亚群。通过转基因表达荧光蛋白，基于 IEG 的方法能够提供激活神经元的大规模 “快照”。然而，由于 IEG 的活性依赖性表达在不同神经元类型和脑区之间差异很大，基于 IEG 的报告结果往往难以解释和推广到不同的神经回路。此外，其较差的时间分辨率（通常为几小时到几天）限制了它在研究时间精确的行为过程中的应用。而且，由于缺乏合适的 IEG，基于 IEG 的报告基因目前并不适用于所有实验生物，例如果蝇。

为了提高时间分辨率，科研人员开发了时间门控钙整合器。例如，CaMPARI 是一种钙依赖性光可转换荧光蛋白，能够以亚秒级分辨率永久标记激活的神经元，但它需要短波长光（405nm），这限制了其应用。LiPPI-CLAPon 是一种蓝光和钙门控的酶报告基因，但尚未在神经元培养或体内应用中得到验证。CaMPARI 和 LiPPI-CLAPon 都不允许基于活动的神经回路操纵。

蓝光和钙门控的转录报告基因的出现，为研究提供了更通用、时间精度更高的读数。FLARE 及其更先进的变体 FLiCRE，通过光和钙的双重作用，使跨膜结合的转录因子（TF）能够在蛋白酶切割后转移到细胞核中，从而诱导报告基因或光遗传、化学遗传执行器的转录。与类似的报告基因 Cal-Light 相比，FLARE 系列报告基因具有更快的动力学。然而，目前的 FLARE 报告基因对长时间的神经元活动敏感性较低，且尚未在果蝇中得到验证，果蝇缺乏在行为过程中报告和操纵神经元活动的时间门控转录系统。

cytoFLARE 的设计与优化

为了解决现有技术的不足，研究人员开发了 cytoFLARE（胞质表达型 FLARE），这是 FLARE 的一种改进变体。在 cytoFLARE 的设计中，研究人员首先用一个胞质结构域取代了 FLARE 中阻止 TF 进入细胞核的跨膜结构域。这样做的原理是，位于胞质中的 TF 可以更容易地与胞质中的 TEV 蛋白酶形成钙依赖性复合物，促进蛋白酶切割依赖的 TF 释放到细胞核中。为了将 TF 定位在胞质中，研究人员将 TF 构建体与超生理核输出信号肽（SNES3）或突变的雌激素配体结合域（ER^T2）融合。实验表明，ER^T2能够有效地将 TF 排除在细胞核外，在基础状态下显示出低背景转录激活，而在蓝光和高钙条件下则能激活报告基因表达，因此研究人员在 cytoFLARE 设计中使用了 ER^T2。

为了提高 cytoFLARE 对钙水平变化的敏感性，研究人员将 GCaMP6s 中的突变引入到 cytoFLARE 的 CaM 中，以提高其对钙的亲和力。然后，他们筛选了四种对钙结合的 CaM 具有不同亲和力的 MK2 变体，并在 1 分钟的光和钙刺激下进行测试。结果发现，去除 MK2 中的 K8A 突变显著增强了光和钙依赖性信号，同时在基础状态下保持了低背景信号。为了尽量减少内源性 CaM 的干扰，研究人员选择在 cytoFLARE 设计中使用 MK2（T13F），此时光依赖性信噪比（SBR，平均激活信号与平均背景信号的比值）为 8.4，钙依赖性 SBR 为 6.5。

为了进一步提高 cytoFLARE 的光依赖性 SBR 和激活效率，研究人员测试了不同的 LOV 结构域和 TEVp。他们发现，hLOV1 结构域在 cytoFLARE 中提供了最高的 SBR，而 hLOV1（I26V）虽然 SBR 略低于 hLOV1，但它能够使光刺激的 LOV 结构域在黑暗中更快地重置，提供了更快的时间分辨率，因此研究人员选择在后续的 cytoFLARE 设计中使用 hLOV1（I26V）。在对不同动力学的 TEVp 进行筛选后，研究人员发现 TEVp（S153N）在 cytoFLARE 中表现较好，最终将包含 MK2（T13F）、hLOV1（I26V）和 TEVp（S153N）的 cytoFLARE 变体命名为 cytoFLARE1.0。

cytoFLARE1.0 在细胞培养中的性能评估

为了评估 cytoFLARE1.0 的性能，研究人员将其与 FLiCRE 在 HEK293T 细胞中进行了比较。他们还构建了 FLiCRE2，将 cytoFLARE1.0 中的最佳组件整合到 FLiCRE 中。结果显示，在 1 分钟的光和高钙刺激下，cytoFLARE1.0 和 FLiCRE2 都比 FLiCRE 提供了更高的信号，但 FLiCRE2 在仅钙刺激的条件下背景更高，因此研究人员选择 cytoFLARE1.0 进行进一步研究。

研究人员还对 cytoFLARE1.0 在 HEK293T 细胞中的时间敏感性进行了研究。他们分别用 1 分钟和 5 分钟的光和钙刺激，使用 GAL4 驱动的 mCherry 或荧光素酶作为报告基因。结果表明，5 分钟刺激时，cytoFLARE1.0 的光和钙依赖性报告基因激活更高。在 1 分钟和 5 分钟的刺激条件下，cytoFLARE1.0 的光和钙依赖性报告基因表达信号比 FLiCRE 高约 2 倍，但在 5 分钟刺激时，由于背景增加，SBR 并不总是显著增加。

在原代大鼠神经元培养中，研究人员使用四环素控制的反式激活因子（tTA）驱动的 mCherry 报告基因，对基于 FLARE 的报告基因进行了时间敏感性表征和比较。他们用 GABA 受体拮抗剂荷包牡丹碱处理细胞 1 分钟和 5 分钟，同时施加脉冲蓝光（2 秒开 / 4 秒关）以诱导神经元中的钙瞬变。结果显示，在 5 分钟刺激时，cytoFLARE1.0 比 FLiCRE 提供了更高的 SBR，而在 1 分钟刺激时，两者都未能显著激活，这表明 FLARE 系统在神经元培养中的敏感性可能低于在 HEK293T 细胞中。研究人员还用另一种去极化刺激 —— 高细胞外钾（KCl）对 cytoFLARE1.0 在神经元培养中的性能进行了评估，结果与荷包牡丹碱处理一致，在光和神经元刺激条件下，高 KCl 处理导致 cytoFLARE1.0 显著激活。此外，研究人员还测试了 cytoFLARE1.1，它与 cytoFLARE1.0 具有相同的 TF 构建体，但使用 CaM-TEVp（T30A 和 S153N）以实现更快的蛋白酶动力学，结果显示 cytoFLARE1.1 相比 cytoFLARE1.0 在激活方面仅有轻微改善。

cytoFLARE1.0 在果蝇幼虫神经元活动记录中的应用

研究人员构建了表达 cytoFLARE1.0 两个组件（ER^T2 - tethered TF（LexA）和 CaM - TEVp）的转基因果蝇品系。这两个组件都由上游激活序列（UAS）启动子驱动，这些 UAS 转基因品系可以与 GAL4 驱动品系杂交，从而在特定类型的神经元中表达 cytoFLARE。为了报告 LexA 的转录活性，研究人员将 LexAop2 - mCherry 转基因引入果蝇。

在果蝇幼虫的初步测试中，研究人员将 cytoFLARE1.0 转基因表达在 Basin - 4 神经元中，这是一种伤害感受通路中的二级神经元（SONs）。他们用 39°C 的热刺激作为伤害性刺激，同时用蓝光激活 cytoFLARE1.0。刺激后，幼虫在黑暗中饲养 16 小时，以允许 mCherry 报告基因的转录和翻译。在初始测试中，即使没有热刺激或蓝光，也观察到了 mCherry 的表达。通过对照实验发现，这种背景 mCherry 表达是由于共表达的 TEVp 的切割，而不是 TF 组件的错误定位或内源性蛋白酶的切割，可能是由于 cytoFLARE1.0 转基因在幼虫发育过程中的过表达导致。

为了减少幼虫发育过程中报告蛋白的背景积累，研究人员使用温度敏感的 GAL80 转基因（GAL80^ts）将 cytoFLARE 组件的表达限制在更窄的时间段内。GAL80^ts在允许温度（如 18°C）下可以抑制 GAL4/UAS 系统，而在限制温度（如 31°C）下则失去活性，通过控制果蝇生活环境的温度，可以控制 UAS 转基因的表达时间。研究人员将转基因幼虫在 31°C 下培养不同时间，发现 85 小时和 114 小时的培养都能使 cytoFLARE1.0 充分表达，并且在 5 分钟的光和有害热刺激下，mCherry 报告基因有显著表达。由于 114 小时培养在黑暗条件下产生的背景较高，研究人员选择 85 小时的 GAL4 - UAS 表达来进一步表征 cytoFLARE1.0。

研究人员测试了 cytoFLARE1.0 对记录有害热刺激（39°C）引起的神经元活动的敏感性。结果发现，3 次和 5 次热刺激脉冲能显著增加表达 mCherry 的 Basin - 4 神经元数量，而 1 次脉冲则不能，这表明 cytoFLARE 的激活依赖于神经元活动，但对更短暂的钙反应的敏感性可能需要进一步提高。

研究人员还研究了激活果蝇幼虫中 cytoFLARE1.0 所需的蓝光强度。结果表明，100 和 200 μW/mm²的蓝光强度能诱导光和热依赖性信号的显著增加，而 50 μW/mm²则不能。

除了热刺激，研究人员还研究了 cytoFLARE1.0 是否能被上游或突触前神经元的光遗传刺激激活。他们在幼虫的伤害感受器中表达红色光敏感的光遗传执行器 CsChrimson，并对不同强度的红色光刺激进行测试。结果发现，当红色光强度为 35 μW/mm²或更高时，同时暴露在红色光和蓝光下的幼虫中，mCherry 阳性的 Basin - 4 神经元数量显著增加，且随着红色光强度从 20 μW/mm²增加到 50 μW/mm²，mCherry 阳性细胞数量显著增加，并在 50 μW/mm²时达到饱和，这表明 cytoFLARE1.0 可以在广泛的动态范围内被光遗传刺激激活。

cytoFLARE1.0 对果蝇幼虫神经元活动的操纵

记录神经元活动有助于识别在行为过程中被激活的神经元，而操纵这些激活的神经元对于确定它们在这些过程中的重要作用至关重要。在果蝇幼虫的伤害感受系统中，A08n 神经元是对伤害感受器激活最敏感的 SONs 类型。研究人员选择 A08n 神经元来评估 cytoFLARE 对光遗传重新激活的能力。通过 GAL4/UAS 系统在 A08n 神经元中表达 CsChrimson，光遗传激活 A08n 神经元会引发特征性的伤害感受回避行为，包括身体卷曲的次数和持续时间增加，以及滚动的概率更高。

研究人员在 A08n 神经元中表达 cytoFLARE1.0 转基因和 CsChrimson 作为报告基因。他们用有害热（39°C，5 分钟）和 450nm 蓝光（100 μW/mm²）刺激幼虫的伤害感受器，激活 cytoFLARE1.0。刺激后，幼虫在黑暗中饲养 16 小时，使 CsChrimson 表达。随后，用 617nm 红色光（100 μW/mm²）刺激 CsChrimson，并记录行为反应。结果显示，与对照组相比，同时接受热刺激和蓝光刺激（+ heat，+ light）的幼虫表现出更多的卷曲次数和更长的卷曲持续时间，以及更高的身体滚动概率，这些都是特征性的伤害感受反应。

研究人员还测试了 cytoFLARE1.0 基于先前活动水平抑制 A08n 神经元的能力。他们在 A08n 神经元中表达 GtACR1，这是一种用于神经元抑制的光遗传执行器。首先，直接在 A08n 神经元中表达 GtACR1，光遗传抑制 A08n 神经元显著降低了幼虫对有害热的回避反应。然后，用有害热和蓝光激活 cytoFLARE1.0（+ heat，+ light），并在黑暗中培养 16 小时使 GtACR1 表达。之后，在有害热刺激的同时用 617nm 红色光（100 μW/mm²）激活 GtACR1。结果发现，在 + heat，+ light 组中，由于 cytoFLARE 诱导了 GtACR1 的表达，伤害感受行为与对照组相比显著受到抑制。

研究总结与展望

本研究中，研究人员开发了改进的 FLARE 报告基因 cytoFLARE1.0，它通过 ER^T2融合将 TF 组件锚定在细胞质中，便于与 CaM - TEVp 组件相互作用，并结合了更高亲和力的 CaM - MK2 对和快速重置的 LOV 结构域，提高了激活效率。研究人员在果蝇幼虫中建立了 cytoFLARE1.0 的应用，发现使用 GAL4 - GAL80 转录系统将 cytoFLARE1.0 组件的表达限制在实验前 2 - 3 天，有助于降低背景激活。cytoFLARE1.0 能够标记由 3 次 1 分钟有害热刺激和蓝光共同刺激激活的 Basin - 4 神经元，也能标记由突触前神经元（伤害感受器）的光遗传刺激激活的 Basin - 4 神经元。此外，通过 cytoFLARE1.0 可以重新激活或抑制 A08n 神经元，从而驱动或抑制果蝇幼虫的有害反应。

cytoFLARE1.0 系统填补了目前果蝇中标记激活神经元的时间门控工具的空白，将有助于改善对果蝇神经回路及其功能的分析。果蝇幼虫为测试 cytoFLARE 和其他时间门控钙整合器提供了强大的平台，例如光可以直接应用于幼虫，无需植入光纤，且转基因的表达水平比混合病毒注射更一致。

然而，使用 cytoFLARE1.0 在活体生物中标记激活的神经元仍面临一些挑战。作为一个多组件报告系统，cytoFLARE1.0 高度依赖蛋白质表达水平，需要对其组件的表达进行微调，以在不同的神经回路和生物体中获得最佳性能。此外，cytoFLARE1.0 的敏感性仍然有限，在原代培养神经元和果蝇幼虫中都需要数分钟的刺激。开发具有更快动力学蛋白酶的 cytoFLARE 可能会进一步提高其在活体生物中的敏感性。最后，cytoFLARE1.0 依赖蓝光进行时间门控，蓝光在不透明组织中的穿透性有限，需要进一步研究其在成年果蝇中的光穿透性。尽管如此，cytoFLARE1.0 作为一种改进的钙整合器，能够以分钟级的时间敏感性标记活跃的神经元群体，并为进一步研究特定神经元群体与动物行为之间的因果关系提供了有力工具，且该技术有可能应用于其他生物体。