葡萄糖在表皮分化中的关键作用：代谢与转录调控的新发现

《Cell Stem Cell》：Glucose modulates IRF6 transcription factor dimerization to enable epidermal differentiation

本文揭示葡萄糖在表皮分化中积累，通过结合 IRF6 调控基因表达，影响细胞分化进程。

　　

引言

在生物体的生长发育过程中，体细胞组织分化是一个至关重要的环节，它涉及 RNA 转录本、蛋白质以及其他小分子水平的协调变化，以实现组织特异性功能。以皮肤表皮角质形成细胞为例，其分化过程伴随着数千个基因表达的改变，最终形成皮肤屏障的重要组成部分 —— 角化细胞。这一复杂过程背后的生物分子机制一直是科研人员关注的焦点，虽然转录水平的变化已在许多细胞类型中有所研究，但代谢组在体细胞组织分化过程中的变化以及代谢物对细胞状态的调控作用，仍有待深入探索。

转录因子（TFs）在表皮分化中起着不可或缺的作用，如分层上皮谱系 TF p63，以及 ZNF750、MAF、MAFB、GRHL3、HOPX 和 PRDM1 等促分化 TF，它们的表达在分化过程中被诱导。然而，像 IRF6 这样在表皮分化和发育中至关重要的 TF，在祖细胞和分化细胞中稳定表达，其转录激活机制尚未完全明确。深入理解 IRF6 和其他分化相关 TF 的调控机制，对于揭示组织稳态的奥秘具有重要意义。

代谢组学作为一门新兴学科，能够整合转录组学和蛋白质组学数据，为研究细胞功能提供更全面的视角。通过对不同细胞类型分化过程中代谢组的研究，已发现许多与细胞分化相关的代谢物变化。例如，在 B 淋巴细胞、软骨细胞和脂肪细胞的分化研究中，均鉴定出了重要代谢途径中的变化代谢物。近年来，随着多组学技术的融合，代谢状态差异的研究得到了进一步深化，为揭示细胞分化的代谢调控机制提供了新的契机。

葡萄糖作为生命活动中最重要的能量物质之一，在细胞代谢中扮演着核心角色。它通过糖酵解、戊糖磷酸途径（PPP）和己糖胺途径（HBP）等代谢途径产生 ATP，为细胞的各种生理功能提供能量。然而，越来越多的证据表明，葡萄糖在组织稳态中可能具有独立于能量代谢的功能。例如，高血糖状态下，成纤维细胞增殖受损，干细胞的治疗应用也受到不利影响，同时高血糖还会促进成骨分化。尽管如此，葡萄糖水平如何直接调控自我更新组织中的细胞生长和分化，其非能量机制仍不明确。

在本研究中，科研人员发现自由葡萄糖在表皮分化过程中积累，且这一过程不依赖于葡萄糖分解代谢的增加。葡萄糖的积累需要 SGLT1、GLUT1 和 GLUT3 等葡萄糖转运蛋白的参与，阻断葡萄糖积累会损害表皮分化。此外，研究还发现葡萄糖能与多种蛋白质结合，其中包括 IRF6 转录因子。葡萄糖与 IRF6 的结合改变了 IRF6 的蛋白构象，促进其二聚化、DNA 结合和基因组定位，进而调控 IRF6 靶基因的表达，这些靶基因中包含许多促分化 TF，如 GRHL1、GRHL3、HOPX 和 PRDM1。这一系列发现揭示了葡萄糖在表皮分化过程中动态基因组调控的非能量功能，为深入理解细胞分化的分子机制提供了新的线索。

结果

葡萄糖积累是分化的特征

为了探究表皮分化过程中细胞内生物分子的变化，科研人员运用 5 种质谱（MS）技术，对人表皮角质形成细胞分化过程中的细胞内生物分子进行了定量分析。研究对象包括未分化的角质形成细胞，以及在体外经钙诱导分化 3 天（早期分化）和 6 天（晚期分化）的角质形成细胞。结果显示，在分化过程中，共有 193 种生物分子发生了变化，其中一些已被证实与皮肤终末分化相关，如 γ - 谷氨酰氨基酸转谷氨酰胺酶底物，它们在皮肤屏障形成中发挥着重要作用；同时，一些已知的脂肪酸和反式尿刊酸也有所增加，反式尿刊酸是一种光保护化合物，占角质层的 0.5%，这些结果充分表明了该数据集的生物学相关性。

令人意外的是，自由葡萄糖在角质形成细胞分化过程中是增加幅度第二大的分析物。为了验证这一发现，科研人员采用了四种不同的方法。首先，使用荧光葡萄糖类似物 2 - NBDG 进行实验，它与未标记的 D - 葡萄糖摄取速率相似，且在磷酸化后会失去荧光，可用于检测未代谢的葡萄糖。实验结果显示，分化的表皮细胞内 2 - NBDG 含量增加。其次，利用¹⁴C - 葡萄糖 C6（通过糖酵解代谢）和¹⁴C - 葡萄糖 C1（通过 PPP 代谢）进行实验，均观察到葡萄糖积累现象。再者，³H - 氟脱氧葡萄糖（³H - FDG）虽然可以被磷酸化但不能被代谢，同样呈现出葡萄糖积累的趋势。最后，使用两种葡萄糖传感器 iGlucoSnFR 和 Red Glifon 3000 进行检测，结果表明在体外分化的角质形成细胞以及三维（3D）组织（如人皮肤类器官和小鼠皮肤）中，葡萄糖水平均显著升高。此外，研究还发现，在体外分化的脂肪细胞、成肌细胞和骨细胞中，葡萄糖也会积累，这表明细胞内葡萄糖升高是多种体细胞分化过程中的普遍现象。

葡萄糖升高不伴随分解代谢增加

在发现葡萄糖积累与分化相关后，科研人员进一步探究其积累的基础。研究发现，随着细胞分化，放射性标记的葡萄糖摄取减少，但在 3 小时时，分化细胞内的³H - FDG 含量是祖细胞的两倍。³H - FDG 脉冲追踪实验表明，祖细胞内的³H - FDG 会随着时间显著减少，而分化细胞内则不会，且祖细胞在洗去³H - FDG 后，其培养基中的含量比分化细胞更高，这表明分化的角质形成细胞积累葡萄糖的同时，葡萄糖的输出减少。

那么葡萄糖积累是否是为了增加分解代谢呢？通过检测细胞外酸化率（ECAR）这一衡量糖酵解的替代指标，科研人员发现，在分化过程中糖酵解速率实际上下降了，同时伴随着氧气消耗的增加，这与分化细胞向氧化磷酸化转变的报道一致。此外，在主要葡萄糖代谢途径（糖酵解、PPP 和 HBP）中的 18 种分解代谢产物在分化过程中并未积累，HBP 产物 O - 连接的 β - N - 乙酰葡糖胺（O - GlcNAc）也没有增加。代谢通量分析显示，[U -¹³C] - 葡萄糖掺入糖酵解中间产物的量在分化过程中减少，乳酸和丙酮酸的产生也没有显著增加。值得注意的是，在分化过程中，[U -¹³C] - 葡萄糖转化为 α - 酮戊二酸的量显著增加，这进一步证实了细胞从糖酵解向葡萄糖氧化的转变。同时，研究还发现分化的角质形成细胞中糖原含量比祖细胞少，且用胰高血糖素刺激祖细胞的糖原分解并不能积累细胞内葡萄糖。综合这些结果，表明细胞内自由葡萄糖的积累并非伴随着葡萄糖分解代谢的增加。

在探究了葡萄糖代谢情况后，科研人员推测细胞可能利用其他能量来源。研究发现，在早期分化阶段，脂肪酸代谢途径富集，多种脂肪酸代谢产物增加，包括参与脂肪酸 β - 氧化的重要代谢物乙酰肉碱。同时，脂质代谢调节因子（如 ACSL1 和 ATP - 柠檬酸裂解酶）的表达在祖细胞和早期分化阶段升高，这表明脂质代谢在早期分化中可能发挥重要作用。

自由葡萄糖积累是表皮分化所必需的

为了评估葡萄糖升高对细胞功能的影响，科研人员将角质形成细胞分别培养在标准培养基（4.5 g/L [25 mM] 葡萄糖）和低葡萄糖培养基（0.5 g/L [2.8 mM]）中。结果发现，角质形成细胞在两种培养基中均能正常增殖，但在不含葡萄糖的培养基（即使添加了 1 mM 丙酮酸）中，细胞生长停止。补充糖酵解产物（如过量丙酮酸）、用选择性 O - GlcNAcase 抑制剂刺激 O - GlcNAc 积累或添加氨基酸丝氨酸，都无法挽救细胞增殖，这表明细胞的能量需求依赖于葡萄糖。

与标准培养基相比，葡萄糖限制会降低角质形成细胞内的葡萄糖含量，并抑制表皮分化。在低葡萄糖培养基中培养的人皮肤类器官也表现出分化受损的现象。对在标准或低葡萄糖培养基中培养的表皮类器官进行 RNA 测序，发现有 3208 个基因差异表达，其中在低葡萄糖条件下下调的基因主要涉及表皮分化，且这些基因与已发表的表皮分化基因特征存在显著重叠。

有趣的是，3 - O - 甲基葡萄糖（3MG）这种代谢稳定的葡萄糖类似物能够挽救低葡萄糖培养基中细胞的分化。进一步研究发现，尽管在低葡萄糖培养基中细胞的基础 ATP 生成速率相似，但糖酵解衍生的 ATP 比例略高，ECAR 显著升高，而氧气消耗率（OCR）与标准葡萄糖培养基相似。添加 3MG 后，ECAR 恢复到标准葡萄糖水平，OCR 增加，这表明 3MG 可能部分恢复了分化角质形成细胞的代谢状态，同时也支持了自由葡萄糖本身而非其代谢产物对分化起作用的观点。

为了进一步验证葡萄糖积累在分化中的作用，科研人员通过表达葡萄糖代谢酶来降低细胞内葡萄糖水平。结果发现，强制表达 HK1/2 或 G6PD（PPP 第一步的关键酶）会降低细胞内葡萄糖水平并损害分化，而使用 HK1/2 竞争性结合抑制剂 2DG 或非竞争性 G6PD 抑制剂可以部分恢复细胞内葡萄糖水平并挽救分化。这些结果表明，超出正常细胞存活所需的葡萄糖水平对于角质形成细胞分化至关重要，且自由葡萄糖本身在这一过程中发挥着关键作用。

葡萄糖转运蛋白上调促进分化过程中的葡萄糖积累

既然葡萄糖积累对表皮分化如此重要，那么哪些葡萄糖转运蛋白参与其中呢？科研人员对特定葡萄糖转运蛋白在分化过程中对葡萄糖积累的贡献进行了研究。结果发现，葡萄糖转运蛋白 GLUT1（SLC2A1）和 GLUT3（SLC2A3）在分化的角质形成细胞中略有增加，而钠 - 葡萄糖协同转运蛋白 SGLT1（SLC5A1）增加了超过 50 倍。在正常成人皮肤的单细胞分析中，SLC5A1 几乎只在分化的角质形成细胞中表达，GLUT3 和 SGLT1 主要在表皮的基底上层表达，GLUT1 则主要存在于基底层。

进一步研究发现，促分化 TF（如 p63、ZNF750、KLF4、CEBPα/β 和 IRF6）可以调节这些转运蛋白的表达。通过 CRISPR - Cas9 介导的基因敲除实验，科研人员发现敲除 SLC2A1、SLC2A3 和 SLC5A1 基因会损害分化基因的表达，无论是在二维培养还是表皮类器官中。同时，使用针对 GLUT 家族转运蛋白的抑制剂 WZB117 或针对 SGLT 转运蛋白的抑制剂根皮苷，也会降低细胞内葡萄糖水平并抑制分化。这些数据表明，多种葡萄糖转运蛋白在角质形成细胞葡萄糖升高和分化中发挥着非冗余的作用。

葡萄糖结合 IRF6

葡萄糖能够结合特定蛋白质，如 HK1/2，那么升高的自由葡萄糖是否会结合对分化重要的蛋白质呢？科研人员对分化的角质形成细胞蛋白提取物进行葡萄糖聚合物色谱分析，然后用葡萄糖或半乳糖单糖对照洗脱，并进行液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析。结果发现，在葡萄糖洗脱液中富集的 497 种蛋白质主要集中在与基因表达和蛋白质代谢相关的生物学过程中。其中，18 种葡萄糖结合蛋白在角质形成细胞分化过程中 mRNA 诱导倍数≥2，IRF6 转录因子便是其中之一。

表皮分化伴随着基因组可及性的动态变化，为了探究葡萄糖对此的影响，科研人员对在标准和低葡萄糖培养基中生长的分化角质形成细胞进行了转座酶可及染色质测序（ATAC - seq）分析。结果发现，葡萄糖限制会降低 411 个基因的染色质可及性，同时增加 436 个基因的染色质可及性。在标准葡萄糖培养基中可及性增加的基因与低葡萄糖条件下 RNA 转录本下调的基因相交集，得到 55 个候选直接葡萄糖靶基因，这些基因在表皮分化和皮肤发育中具有重要作用。通过对这些基因的调控区域分析，发现 IRF6 等转录因子可能参与葡萄糖介导的基因调控。

此前研究表明 IRF6 在小鼠表皮发育中至关重要，本研究通过在人表皮类器官中敲除 IRF6，验证了其保守的表皮功能。敲除 IRF6 会损害表皮分化，RNA 测序显示，IRF6 缺失的类器官组织中有 1191 个基因下调，这些基因富集在皮肤发育、表皮分化和鞘脂代谢等方面，与 Irf6 敲除小鼠的表型相似。同时，IRF6 调控的基因与表皮分化特征和葡萄糖依赖的分化基因集存在显著重叠，这表明 IRF6 在介导葡萄糖促进分化的过程中发挥着重要作用。

为了进一步验证葡萄糖与 IRF6 的结合，科研人员使用了点击化学方法，用叠氮共轭葡萄糖类似物 2 - 叠氮 - 2 - 脱氧葡萄糖进行实验。LC - MS/MS 分析在 IRF6 的 DNA 结合域中鉴定出一个独特的肽段，该肽段在叠氮葡萄糖下拉实验中富集。微尺度热泳（MST）实验表明，纯化的重组 IRF6 蛋白与葡萄糖的结合亲和力与经典葡萄糖结合蛋白（GBP）单体 HK1 相似，且 IRF6 对葡萄糖的亲和力与最近发现的 GBP DDX21 和 NSUN2 相似。此外，IRF6 对葡萄糖类似物 3MG 的亲和力与葡萄糖相近，但对葡萄糖 - 6 - 磷酸的亲和力降低了 10 倍。同时，其他促分化 TF（如 OVOL1、CEBPA、MAFB 和 KLF4）未能与葡萄糖结合，这表明葡萄糖与 TF 的相互作用具有选择性。

科研人员还通过化学交联 MS 评估了葡萄糖结合对 IRF6 构象的影响。结果发现，葡萄糖增加了赖氨酸 41 和赖氨酸 429 之间的特定交联，表明葡萄糖可以调节 IRF6 的构象。通过计算机模拟单体和二聚体 IRF6 结构，发现葡萄糖介导的 K41 - K429 交联可能只发生在 IRF6 的二聚体形式中，这表明葡萄糖可能调节 IRF6 的二聚化。进一步通过生成 K41A 和 K429A IRF6 突变体进行实验，发现与野生型 IRF6 相比，强制表达 IRF6^K41A/K429A无法挽救 IRF6 敲低导致的分化缺陷，这表明这些残基对于 IRF6 的促分化功能至关重要。

为了确定 IRF6 中直接结合葡萄糖的残基，科研人员进行了紫外线 C（UVC）交联 MS 实验。结果发现葡萄糖与 IRF6 的 P104 和 N106 残基交联，分子对接研究预测葡萄糖与 IRF6 的结合自由能为 - 5.1 kcal/mol，且葡萄糖位于这些结合残基附近。通过构建 IRF6^P104G和 IRF6^N106A突变体，发现 IRF6^P104G点突变使葡萄糖结合能力降低 8 倍，IRF6^N106A突变体则完全消除了葡萄糖结合能力，且这些突变体在挽救 IRF6 缺失导致的分化缺陷方面均不如野生型 IRF6。通过 CRISPR - Cas9/AAV 介导的基因编辑技术，在正常二倍体人角质形成细胞中引入 P104G 和 N106A 突变，生成的表皮类器官进一步证实了 IRF6 葡萄糖结合残基在 3D 组织分化中的重要性。

葡萄糖调节 IRF6 二聚化和 DNA 结合

在证实葡萄糖与 IRF6 结合后，科研人员进一步探究葡萄糖对 IRF6 基因调控的影响。在体外实验中，添加 350 μM 葡萄糖后，IRF6 与 CRCT1 分化基因位点的同源 DNA 结合序列的结合能力增强了 6 倍，在另一个 IRF6 结合位点（靠近 SFN 分化基因）也观察到类似趋势。而葡萄糖对 MAFB 与 GRHL3 基因位点的结合没有影响，这表明葡萄糖对 TF - DNA 结合的影响具有特异性。通过增加葡萄糖浓度（从 100 到 350 μM），进一步证实了葡萄糖对 IRF6 DNA 结合能力的增强作用，而 MAFB - DNA 结合不受葡萄糖影响。

IRF 家族 TF 的高效 DNA 结合和基因调控需要二聚化，科研人员因此研究了葡萄糖对 IRF6 同源二聚化的影响。结果发现，350 μM 葡萄糖和 3MG 能够增加 IRF6 的二聚化，而半乳糖和 100 μM 葡萄糖则不能。通过共免疫沉淀实验，在分化的角质形成细胞中也验证了葡萄糖能增强 IRF6 二聚体的形成，且 IRF6^S413/424A二聚化缺陷突变体在两种条件下二聚化均减少。在组织水平上，通过邻近连接测定（PLA）发现，在标准葡萄糖培养基中生长的表皮类器官的基底上层检测到 IRF6 二聚化信号，而葡萄糖限制会显著降低该信号。此外，使用生物素 - 葡萄糖实验发现，野生型 IRF6 的二聚体和寡聚体中生物素 - 葡萄糖富集，而葡萄糖结合缺陷突变体中则没有，这进一步表明葡萄糖促进 IRF6 二聚体的形成。

为了研究葡萄糖对 IRF6 基因组定位的影响<