单细胞测序技术助力解开人类胎儿牙齿发育之谜

《Cell Reports》：Integrated multi-omics profiling characterizes the crucial role of human dental epithelium during tooth development

该研究整合多种技术，揭示了人类胎儿牙齿发育机制，为牙齿再生研究提供重要资源。

　　

研究背景

牙齿作为人体重要器官，在咀嚼和交流中发挥关键作用。哺乳动物牙齿发育是一个复杂的过程，涉及牙源性上皮（DE）和下方间充质之间的相互作用，由一系列信号分子调控。理解牙齿发育的分子机制，对基础发育生物学、组织再生以及牙科疾病治疗意义重大。然而，人类早期牙齿发育在细胞和分子层面的认知仍十分有限。

以往对牙齿发育的研究多依赖小鼠等动物模型，但这些模型与人类牙齿存在差异，无法完全反映人类牙齿发育的真实情况。近年来，新技术的发展为研究提供了更精准的手段。本研究整合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、空间转录组学（ST）和分泌组分析，深入探究人类胎儿牙齿发育过程，旨在揭示其细胞和分子机制，为牙齿再生研究提供重要资源。

研究方法

1. 样本采集：研究选取了 12 个人类胎儿牙齿组织样本，涵盖 9 - 10、12、15 和 22 孕周（PCW）。样本来源于首都医科大学附属北京妇产医院的选择性手术流产，获取样本前已获得孕妇的书面知情同意。通过临床超声和胚胎的解剖学标志确定样本的孕周和临床年龄，并对样本进行解剖和处理，用于后续实验。
2. 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）：使用 10× Genomics 的 Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit V3.1 和 Chromium Single Cell B Chip Kit 进行细胞捕获和 cDNA 合成。将细胞悬液加载到 Chromium 单细胞控制器上，生成单细胞凝胶珠乳液，经扩增、质量评估后构建 scRNA-seq 文库，最后用 Illumina Novaseq 6000 测序仪进行测序，测序深度至少为每个细胞 100,000 reads。
3. 空间转录组学（ST）：对牙齿样本进行冷冻切片，厚度为 10μm，将切片固定在 GEX 阵列上，进行苏木精 - 伊红（H&E）染色和 Visium Spatial Gene Expression 实验。利用 Visium Spatial Gene Expression slides 和 Reagent Kits 进行透化、逆转录、cDNA 合成和扩增，构建空间转录组文库，用 Illumina NovaSeq6000 测序仪测序，测序深度至少为每个点 100,000 reads。
4. 数据分析：对原始 scRNA-seq 数据进行预处理，包括细胞条形码解复用、读取比对到人类参考基因组和生成基因计数矩阵。通过质量控制，去除低质量细胞，进行数据归一化、降维和聚类分析。利用 Seurat、DoubletFinder、Harmony 等工具进行数据分析，鉴定细胞类型和亚群，分析基因表达差异和细胞间相互作用。同时，运用 Monocle 3、Velocyto 等工具进行轨迹分析和 RNA 速度分析，推断细胞的发育轨迹和未来状态。

研究结果

1. 牙齿发育的时空单细胞转录组图谱：通过 scRNA-seq 分析，从 6 个人类牙齿样本中获得了 65,460 个细胞，鉴定出 8 个主要细胞类型，包括 DE、牙乳头（DP）、牙囊（DF）、口腔上皮（OE）、内皮细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞和血管周围细胞。GO 富集分析表明，DE 在牙齿形成中起关键作用，与 WNT 信号通路密切相关；DP 参与 T 细胞因子依赖的上皮 WNT 信号应答，以及 Rho GTPase 信号通路和 HOX 基因激活；DF 与 WNT 介导的细胞间信号传导和弹性纤维相关。通过 CellChat 分析发现，DE 与其他细胞群之间的相互作用数量较高，是多个信号通路的主要发送者，如 WNT、NPR2、PDGF 和 PTH 信号通路。利用 ST 技术结合 scRNA-seq 数据，确定了细胞在牙齿发育过程中的空间分布，发现不同细胞类型的标记基因在特定区域表达，且基因表达模式随发育阶段动态变化。
2. 人类 DE 的异质性及动态变化：在牙齿从芽期到钟状期的发育过程中，DE 向其他细胞簇发送的相互作用数量最多。通过整合不同阶段的细胞图谱，利用 RNA 速度和 Monocle 3 分析，发现舌侧外釉上皮（OEE）有向釉结（EK）和内釉上皮（IEE）发展的趋势，星网状层（SR）和中间层（SI）细胞倾向于 KRT6⁺ SR 细胞，可能是 Serre’s 腺体的前体。进一步分析确定了 8 个 DE 细胞亚群，每个亚群具有独特的基因表达模式和功能。例如，KRT6⁺ SR 细胞与表皮发育相关；紧邻间充质的 DE 细胞表现出上皮 - 间充质转化（EMT）特征，与细胞外基质（ECM）发育、骨化和间充质发育有关；高度增殖细胞主要位于颈环（CL）和 IEE 区域；EK 细胞作为信号中心，参与轴突发育和 WNT 信号通路等。
3. DE 细胞基因表达模块的动态变化：通过加权相关网络分析，确定了三个基因模块。模块 1 与 ATP 代谢过程相关，在 9 - 10 PCW 样本中表达占比高，随后下降，表明 ATP 代谢过程是早期牙齿发育的触发因素；模块 2 与细胞稳态相关，在各个发育阶段表达相对稳定；模块 3 与细胞形态发生相关，随着发育阶段推进，其基因表达贡献不断增加。空间映射进一步证实了这些基因模块在 DE 中的动态表达模式，ATP 代谢过程相关基因在 IEE 区域表达集中，暗示 IEE 分化过程中能量消耗较高。
4. DP 细胞的异质性及基因调控网络：DP 细胞根据牙髓和成牙本质细胞谱系分为两个细胞簇，即根尖 DP（ADP）和冠状 CDP 细胞簇。在发育过程中，ADP 细胞簇在 9 - 10 PCW 占主导，随后逐渐演变为 CDP 细胞簇，FGF3⁺细胞群被认为是成牙本质细胞的前体。利用 SCENIC 算法预测了参与 EK、IEE 和 CDP 谱系发育的转录因子，这些转录因子分别属于不同的基因模块。通过 GeneSwitches 分析，确定了在 IEE 和 CDP 细胞命运决定中起关键作用的标记基因，为指导人类牙齿硬组织形成提供了潜在依据。
5. 动态 EMIs 对 DE 和 DP 细胞分化的调控：牙齿发育过程中，上皮和间充质之间存在一系列复杂的相互作用。通过 CellPhoneDB 分析发现，WNT 配体主要由 DE/IEE/EK 分泌，BMP、TGF - β 和 FGF 信号成员主要来自 DP。在帽状期和早期钟状期，随着 EK 的出现，SHH 表达明显，其突变与牙齿发育不全有关。从芽期到钟状期的相互作用景观显示，EK 细胞在早期发育阶段发挥重要作用，许多持续表达的配体与牙齿发育不全相关，如 WNT10A 和 FGF10。
6. DE 和 DM 细胞的分泌蛋白谱：对 12 PCW 的 DE 和 DM 组织进行体外培养，收集上清液进行液相色谱 - 质谱（LC - MS）分析。结果显示，DE 细胞分泌的蛋白质数量多于 DM 细胞，GO 富集分析表明，DE 分泌蛋白与牙发生、细胞迁移和增殖调节相关，DM 分泌蛋白与 BMP 信号和 ECM 组织相关。进一步分析发现，DE 分泌的 WNT5B 在调节 DM 牙源性分化中起关键作用。体外实验表明，重组 WNT5B 可促进人原发性 DM 细胞的牙源性分化，敲低 DE 中的 WNT5B 则抑制 DM 细胞的分化。与 WNT5A 相比，WNT5B 对 DM 细胞分化的刺激作用更强。
7. 人类牙齿发育的时空基因表达模型：综合上述研究结果，提出了一个人类胎儿牙齿发育的时空基因表达模型。DE 由 8 个不同亚群组成，DP 分为两个亚群。DE 主要通过 WNT 信号传递形态发生信号，DP 主要通过 BMP、TGF - β 和 FGF 信号通路发挥作用。从帽状期到钟状期，上皮信号主要来源于 EK 而非 IEE。同时，三个基因模块在牙齿发育过程中呈现动态表达模式，ATP 代谢相关基因表达逐渐下降，细胞形态发生基因表达逐渐上升，细胞稳态相关基因表达相对稳定。

研究讨论

1. 研究成果：本研究构建了全面的人类牙齿发育单细胞转录组图谱，揭示了牙齿发育过程中细胞类型的空间分布、EMI 模式以及上皮来源因子的作用。研究发现 WNT 信号通路、Rho GTPases 和 HOX 基因等在牙齿发育中起重要作用，为深入理解牙齿发育机制提供了新视角。此外，研究还详细描述了人类 DE 细胞亚群的空间分布，发现 KRT6A⁺ SR 细胞可能是 Serres’腺体的前体，这一特征在人类中独特，与小鼠存在差异。通过比较不同研究的方法和结果，进一步验证了本研究的可靠性，为牙齿再生研究提供了重要参考。
2. 基因调控动态变化：研究揭示了人类胎儿牙齿发育过程中基因调控的动态变化。细胞稳态相关基因在各个发育阶段平衡表达，维持细胞内环境稳定；细胞形态发生相关基因随着牙齿形态发生进程表达增强，影响牙齿的形态形成；ATP 信号分子在 IEE 中高表达，为 IEE 的增殖和分化提供能量，表明不同基因模块在牙齿发育中协同作用，共同调控牙齿的形成和发育。
3. EMI 图谱及临床意义：研究绘制了人类胎儿牙齿发育的 EMI 图谱，明确了关键信号通路在牙齿发育中的作用。WNT 信号主要在 DE 中发挥作用，BMP、TGF - β 和 FGF 信号在 DM 中更为活跃。同时，鉴定出多个与牙齿发育不全相关的基因，如 WNT10A、FGF3 等，强调了发育细胞图谱在临床研究中的重要性。此外，研究还发现 RA 信号可增强牙髓干细胞的成骨 / 成牙分化，进一步揭示了牙齿发育过程中信号通路的复杂性和相互作用。
4. 分泌蛋白谱及 WNT5B 的作用：本研究分析了 DE 和 DM 细胞的分泌蛋白谱，证实了 EMI 模式中 DE 细胞分泌蛋白的重要性。WNT5B 在 DE 分泌蛋白中表达较高，对人原发性 DM 细胞的牙源性分化具有显著刺激作用，为进一步研究牙齿发育和再生提供了新的靶点。
5. 研究局限性与展望：尽管本研究取得了重要成果，但仍存在一定局限性。ST 技术分辨率有限，可能遗漏小的或罕见的细胞群体；研究仅涵盖了牙齿发育的早期阶段，对后期发育过程了解不足；分泌组分析面临蛋白质瞬态和低丰度的挑战。未来研究需要借助更先进的技术，如更高分辨率的单细胞成像技术、更灵敏的蛋白质检测方法等，深入探究牙齿发育的全过程，为牙齿再生和相关疾病治疗提供更全面的理论基础。}