《BMC Microbiology》：MPSeqM, a tool combining multiplex PCR and high-throughput sequencing to study the polymorphism of eight Leptosphaeria maculans avirulence genes and its application to field surveys in France
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为监测油菜黑斑病菌（Leptosphaeria maculans）毒性分离株，研究人员开发 MPSeqM 工具，可用于监测病菌种群及抗性突破。
《油菜黑斑病菌无毒基因多态性研究的新突破》
在农业生产的大舞台上，油菜作为重要的经济作物，却常常遭受病虫害的威胁。其中，油菜黑斑病菌（Leptosphaeria maculans）引发的茎溃疡病，如同一场可怕的 “瘟疫”，严重影响着油菜的产量和质量。
目前，利用含有主要抗性基因（Rlm）的品种是控制该病的主要手段。然而，黑斑病菌种群会迅速进化出毒性，导致 Rlm 基因失效。以往监测黑斑病菌种群的方法，如大规模分离采样和接种测试，不仅耗时耗力，且难以进行高通量分析和检测罕见突变事件。因此，开发一种高效、准确的监测工具迫在眉睫。
法国国家农业、食品与环境研究院（INRAE）的研究人员积极投身于这一研究领域，开展了一项极具意义的研究。他们开发了一种名为 MPSeqM（Multiplex on Pools and Sequencing with MiSeq）的工具，该工具结合了多重 PCR 和 Illumina 测序技术，用于研究 8 个黑斑病菌无毒基因（AvrLm）的多态性，并将其应用于田间调查。这一研究成果发表在《BMC Microbiology》上。
研究人员在研究过程中用到了多个关键技术方法。首先是样本采集，包括 71 个已知的黑斑病菌分离株、32 个分离株的叶斑样本，以及从 9 个油菜田采集的约 1300 个症状样本。接着进行 DNA 提取，针对不同样本采用不同试剂盒提取 DNA。然后通过精心设计引物进行多重 PCR 扩增，再利用 Illumina MiSeq 技术对 PCR 产物测序。最后，将测序数据在 AvrLm 序列数据库中进行比对分析。
研究结果主要如下：
- 引物设计及方法验证：设计的引物能有效扩增 AvrLm 基因部分区域，包含多数已知多态性位点。MPSeqM 工具在检测已知样本 DNA 池时表现出色，具有良好的通用性、可重复性、定量性，能有效检测稀有和新的等位基因变异。
- 检测和量化缺失：通过使用含有不同比例缺失基因的 DNA 稀释系列，以 Actin 基因为参照，成功量化了 AvrLm 基因的缺失比例，建立了标准曲线用于计算样本中基因缺失的比例。
- 阈值确定及方法验证：利用重复实验和多种对照确定了可靠 OTU（操作分类单元）的筛选阈值，去除了潜在的 PCR 或测序假象。在对照样本上的验证结果显示，该方法检测到的等位基因比例与预期高度相关（R2>0.98）。
- 分析未知田间样本：在 42 个田间样本中，发现了许多新的 AvrLm 基因等位基因。对各基因进行分析，发现不同基因的多态性水平差异很大。例如 AvrLm11 基因，检测到 27 个新 OTU，部分突变导致蛋白截断，产生毒性等位基因；而 AvrLm2 基因则几乎没有新等位基因，且 AvrLm2_0_A 等位基因占主导。同时，通过与传统表型分析和 Sanger 测序对比，MPSeqM 工具得到的结果与之高度相关，表明其准确性较高。
研究结论和讨论部分指出，MPSeqM 工具无需繁琐的病菌分离、体外培养和接种步骤，就能精确表征黑斑病菌种群在 8 个无毒基因位点的毒性。该工具揭示了不同位点的多态性差异，发现了许多新的稀有等位基因，为进一步研究植物基因型与病菌等位基因变异的关系等问题提供了新视角。同时，MPSeqM 工具也存在一定局限性，如部分基因扩增片段较短，可能无法检测到某些突变；对于 AvrLm4 - 7 基因，部分毒性分离株可能会被误判为无毒。但总体而言，该工具为油菜黑斑病菌的研究和防治提供了重要的技术支持，有助于更有效地管理 Rlm 基因，早期发现抗性突破，对保障油菜生产具有重要意义。
