全基因组亚硫酸氢盐测序揭示荷斯坦公牛 X 和 Y 精子常染色体甲基化差异，为性别控制技术发展提供关键线索

《BMC Genomics》：Whole-genome bisulfite sequencing of X and Y sperm in Holstein bulls reveals differences in autosomal methylation status

为探究荷斯坦公牛 X 和 Y 精子分子差异，研究人员利用全基因组亚硫酸氢盐测序，发现众多差异甲基化基因，为性别控制技术提供依据。

　　在畜牧业中，荷斯坦奶牛的性别比例对牛奶生产效益有着至关重要的影响。一直以来，人们都期望能够精准地控制奶牛的性别，让母牛的数量增多，这样就能产出更多的牛奶，进而提升农场的经济效益。目前，流式细胞术分选 X 和 Y 精子是牛性别控制的主要商业方法，它是利用 X 和 Y 精子 DNA 含量大约 3.8% 的差异来实现的。然而，这种方法存在不少缺点，比如成本高、分选速度慢，而且用分选后的精液进行人工授精，还会出现受精率降低、胚胎发育受影响等问题。所以，开发新的性别控制策略成为了科研领域的重要研究方向。

在探索 X 和 Y 精子差异的过程中，过去的研究主要集中在蛋白质组学和转录组学方面，对于 DNA 甲基化这一重要的表观遗传修饰在 X 和 Y 精子间的差异，人们了解得还很少。DNA 甲基化是一种稳定的表观遗传机制，和精子质量、精子发生过程密切相关。例如，某些基因位点的异常甲基化会导致精子活力下降、精子数量减少等问题。但是，在牲畜的 X 和 Y 精子 DNA 甲基化差异研究方面，还存在很大的空白。

为了填补这一空白，华中农业大学等研究机构的研究人员开展了一项研究。他们以荷斯坦公牛为研究对象，利用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）技术，系统地比较了 X 和 Y 精子的常染色体甲基化谱。该研究成果发表在《BMC Genomics》上。

研究人员用到的主要关键技术方法包括：首先，从三只健康且具有生育能力的荷斯坦公牛采集精液样本，通过人工阴道采集后，利用 Hoechst-33,342 荧光染料染色，再用高速 MoFlo SX XDP 流式细胞仪将精子分选为 X 和 Y 精子，得到纯度高于 90% 的样本。然后，提取精子基因组 DNA，构建 WGBS 文库进行测序。测序后的数据通过 FastQC 和 Trim Galore 评估质量，用 Bowtie2 比对到参考基因组，Bismark 提取甲基化胞嘧啶信息，还运用了 R 包 methylKit 等进行数据分析。

研究结果如下：

• X 和 Y 精子甲基化组特征：研究人员对 X 和 Y 精子进行 WGBS 测序，每个样本平均获得 630,462,105 条清洁读数，平均映射率为 69.75%，基因组覆盖度至少 21×。甲基化主要发生在 CG 环境中，平均甲基化水平在 71.70% - 77.40% 之间，非 CG 环境甲基化水平很低。精子样本间甲基化模式高度保守，重复序列如 LINEs、SINEs 等甲基化水平高，卫星重复序列甲基化水平低，基因启动子区域甲基化水平低于 20% ，内含子甲基化水平高于外显子，CpG 岛（CGIs）甲基化水平也较低。
• X 和 Y 精子差异甲基化区域（DMRs）的鉴定：通过相关性分析和聚类分析发现，X 和 Y 精子甲基化差异相对较小。不过，研究人员还是鉴定出了 12,175 个 DMRs，其中 X 精子中低甲基化 DMRs 有 5,967 个，高甲基化 DMRs 有 6,208 个。eCGIs 和启动子区域是 DMRs 主要富集的基因组特征。
• 与 DMRs 重叠基因的功能富集分析：在 X 精子中，有 1,050 个基因与低甲基化 DMRs 重叠，991 个基因与高甲基化 DMRs 重叠。GO 富集分析显示，高甲基化基因主要与 GABA-A 受体复合物、细胞对 cAMP 的反应等相关；低甲基化基因主要与 ATP 结合、细胞外谷氨酸门控离子通道活性等有关。KEGG 富集分析表明，高甲基化基因在 cAMP 信号通路、GABA 能突触等途径显著富集；低甲基化基因在催产素信号通路、长期抑郁等过程有显著富集。
• 与精子表观遗传学相关的关键差异甲基化基因（DMGs）的鉴定：研究发现，高甲基化基因 SPA17 和 CHCHD3 之前被报道为牛 X 和 Y 精子中差异表达的膜蛋白。这两个基因在 X 精子中的高甲基化状态与它们较低的蛋白质表达水平相对应，暗示 DNA 甲基化可能抑制基因表达。此外，研究人员还鉴定出 28 个与精子发生和精子细胞发育相关的 DMGs，以及 5 个与受精相关的 DMGs。

研究结论和讨论部分指出，虽然之前有很多关于 X 和 Y 精子的蛋白质组学和转录组学研究，但对 DNA 甲基化的作用了解不足。该研究虽然发现 X 和 Y 精子整体甲基化谱保守，但局部分析找到了 2,041 个 DMGs，这些基因富集在能量代谢和膜电压调节等精子功能关键过程中。例如，SPA17 和 CHCHD3 的高甲基化影响其功能，可能导致 X 和 Y 精子在质量和活力上的差异。同时，研究还发现了与精子发生和受精相关的关键 DMGs，这表明 DNA 甲基化可能是驱动 X 和 Y 精子功能差异的重要因素。不过，该研究也存在一些局限性，如分选精子纯度不完全、未评估分选前后甲基化谱、未直接评估某些基因作为精子性别鉴定生物标志物的潜力、样本量有限等。未来的研究可以从整合多组学数据、在更多样化的群体中验证候选 DMRs 等方面展开。

总的来说，这项研究为深入理解精子表观遗传学提供了重要依据，有助于推动性别控制技术的发展，虽然存在局限，但也为后续研究指明了方向，在畜牧繁殖领域有着重要的理论和实践意义。