染色体级基因组解析：两种青牛胆属植物萜类生物合成中 MEP 途径的差异调控

《BMC Biology》：The chromosome-scale genomes of two Tinospora species reveal differential regulation of the MEP pathway in terpenoid biosynthesis

为探究植物基因家族扩张与代谢差异，研究人员对两种青牛胆属植物基因组测序，揭示 MEP 途径调控差异。

　　在植物的进化历程中，基因家族的扩张与植物表型的变化之间存在着极为复杂的关系。基因家族的扩张通过新功能化和亚功能化，为植物表型带来了丰富的多样性，尤其是在代谢物方面。然而，这种扩张所带来的负面调控效应却一直是科学界尚未完全解开的谜题。就拿青牛胆属的两种植物来说，它们在传统医学领域有着重要的地位。其中，东南亚的毛青牛胆（Tinospora crispa）能够降低血糖、治疗风湿病；而原产于中国南方、印度和斯里兰卡的中华青牛胆（Tinospora sinensis）则可用于舒筋活络、止痛。这两种植物的主要生物活性成分都是萜类化合物，比如从毛青牛胆中分离出的二萜类化合物博拉佩托苷 A（Borapetoside A）、博拉佩托苷 C（Borapetoside C）和博拉佩托苷 E（Borapetoside E），具有抗糖尿病活性，对治疗糖尿病及其他代谢疾病有潜在价值；中华青牛胆中的 1 - 去乙酰基青牛胆苷 A（1-deacetyltinosposide A）对 HeLa 细胞表现出细胞毒性。但由于缺乏这两种植物的基因组数据，人们对其代谢多样性的分子机制知之甚少。

为了深入了解植物代谢物多样性以及这两种植物独特的进化特征，中国科学院昆明植物研究所、西双版纳热带植物园等机构的研究人员展开了深入研究。他们对毛青牛胆和中华青牛胆进行了基因组测序，并结合转录组、代谢组和分子实验进行分析。相关研究成果发表在《BMC Biology》杂志上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是基因组测序技术，包括 Illumina 测序、Nanopore 测序和 Hi-C 测序，用于获取高质量的基因组数据；其次是代谢物提取和分析技术，通过液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）对植物代谢物进行鉴定和定量分析；此外，还运用了生物信息学分析方法，如构建系统发育树、进行基因家族分析和 KEGG 富集分析等，来探究基因的进化和功能。

研究结果主要体现在以下几个方面：

1. 代谢物差异分析：对毛青牛胆和中华青牛胆的叶和茎中的代谢物进行分析，共鉴定出 1178 种代谢物，分为 16 类。主成分分析（PCA）显示，样本分为四个不同的组，表明两种植物的代谢物存在差异。毛青牛胆叶和茎中分别有 457 种和 404 种差异积累代谢物（DAMs），主要为萜类、黄酮类和生物碱。在萜类化合物中，毛青牛胆叶中 20 种三萜类化合物含量显著高于中华青牛胆，二萜类化合物如异迷迭香酚（isorosmanol）、7-O - 甲基迷迭香酚（7-O-methylrosmanol）和博拉佩托苷 E 的含量分别是中华青牛胆叶中的 420.29 倍、215.39 倍和 56.98 倍。茎中也有类似差异，如博拉佩托苷 E 和钩藤酮（uncinatone）等二萜类化合物以及 α- 香树酸（alphitolic acid）等三萜类化合物在毛青牛胆中的含量明显高于中华青牛胆。
2. 基因组测序与组装：成功测序并组装了两种植物的基因组。毛青牛胆基因组大小约为 962.85 Mb，中华青牛胆基因组大小约为 924.82 Mb，二者的 contig N50 分别为 7.42 Mb 和 6.44 Mb。BUSCO 评估显示，基因组组装完整性较高，毛青牛胆为 96.34%，中华青牛胆为 96.03%。通过 Hi-C 辅助组装，将大部分基因组序列锚定到 13 条假染色体上，染色体数目与文献报道一致。
3. 基因组注释与结构分析：对基因组进行注释，发现毛青牛胆和中华青牛胆的转座元件（TE）分别占基因组大小的 78.84% 和 65.19%，其中长末端重复序列（LTR）占比最大。预测出毛青牛胆有 19526 个基因，中华青牛胆有 19947 个基因，约 90% 的基因得到功能注释。同时，还预测了非编码 RNA。基因组共线性分析表明，两种植物的基因组序列相似性较高，但在染色体 12 以及染色体 1 和 2 上存在较大的非共线区间。
4. 比较基因组分析：构建了包含 13 种开花植物的系统发育树，结果显示青牛胆属与小檗科、毛茛科在约 9402 万年前分化，毛青牛胆和中华青牛胆在约 658 万年前分化。通过同义核苷酸替换（Ks）分析发现，两种植物在 Ranunculales 中经历了一次古老的全基因组复制（WGD）事件，但没有发生谱系特异性的 WGD 事件。KEGG 分析表明，毛青牛胆中扩张的基因显著富集于 “异黄酮生物合成” 途径，而中华青牛胆中扩张的基因则富集于 “倍半萜和三萜生物合成” 以及 “单萜生物合成” 途径。
5. 萜类生物合成相关基因分析：研究发现，除中华青牛胆中的 1 - 羟基 - 2 - 甲基 - 2-(E)- 丁烯基 4 - 二磷酸合酶（HDS）基因外，参与萜类生物合成的 MEP 和甲羟戊酸（MVA）途径相关基因在不同物种中的拷贝数相对相似。中华青牛胆含有 7 个 HDS 基因（TsiHDS1 - TsiHDS7），由分散重复产生。其中，TsiHDS4 与大多数物种的 HDS 基因具有良好的共线性，可能保留了祖先功能，而其他 TsiHDS 基因存在结构缺失。此外，对参与萜类生物合成基因的表达模式分析发现，毛青牛胆中负责三萜类化合物生物合成的氧化角鲨烯环化酶基因（OSCs）和负责二萜类化合物生物合成的萜烯合酶基因（TPSs）的表达水平普遍高于中华青牛胆。
6. 蛋白质互作与催化活性分析：通过荧光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）实验发现，TsiHDS4 能与非规范 CDS 衍生的小肽 TsiHDS5 相互作用，且 TsiHDS5 可与 TsiHDS4 的插入结构域（A * 结构域）结合。对 TsiHDS4 和 TsiHDS5 的催化活性研究表明，TsiHDS4 能催化甲基赤藓醇环二磷酸（MEcPP）转化为 (E)-4 - 羟基 - 3 - 甲基丁 - 2 - 烯基二磷酸（HMBPP），促进下游萜类化合物的生物合成；而 TsiHDS5 本身无催化活性，但与 TsiHDS4 相互作用后，会抑制 TsiHDS4 的催化功能，导致 HMBPP 和异戊烯焦磷酸（IPP）含量降低，进而影响萜类化合物的生物合成。

研究结论和讨论部分指出，虽然毛青牛胆和中华青牛胆具有相似的基因组结构，但它们的代谢物类型和含量存在显著差异。基因家族扩张导致的基因功能多样化是造成这种差异的重要原因。中华青牛胆中 HDS 基因家族的扩张，以及 TsiHDS5 与 TsiHDS4 的相互作用对 MEP 途径中萜类化合物生物合成前体的负调控，为植物代谢多样性的遗传机制提供了新的见解。这一研究不仅有助于深入理解植物基因家族扩张与代谢调控之间的关系，也为进一步开发利用青牛胆属植物的药用价值奠定了理论基础。