从嗜热脂肪地芽孢杆菌中挖掘耐热木聚糖酶：生物质转化的新希望

《Microbial Cell Factories》：Isolation, expression, and in silico profiling of a thermostable xylanase from Geobacillus stearothermophilus strain NASA267: insights into structural features and agro-waste valorization

研究人员克隆并表达嗜热脂肪地芽孢杆菌 NASA267 的 xyl267，其在高温碱性下活性良好，利于生物质转化。

　　木聚糖作为植物半纤维素中含量最为丰富的多糖，在自然界聚合物中的地位仅次于纤维素，它是一种复杂的异质聚合物。而木聚糖酶（Xylanase）作为一类能够将木聚糖聚合物水解为简单糖类的水解酶，在生物燃料生产、动物饲料加工、纸张制造以及农业废弃物处理等众多工业和生物技术领域发挥着至关重要的作用。例如，在动物营养方面，基于木聚糖酶的糖化作用能够显著提高肉鸡的饲料转化率，同时增加小麦的表观代谢能含量。

然而，在实际应用中，传统的木聚糖酶往往存在一些局限性。许多常温微生物产生的木聚糖酶在高温环境下容易失活，无法满足一些需要高温处理的工业过程，如生物燃料生产中对木质纤维素的高效降解。此外，不同来源的木聚糖酶在稳定性、底物特异性等方面也存在差异，限制了其在更广泛领域的应用。因此，寻找具有优良特性的木聚糖酶，成为了相关领域研究的重点。

为了解决这些问题，来自埃及和沙特阿拉伯的研究人员开展了一项关于从嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）中分离、表达和分析耐热木聚糖酶的研究。这项研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为生物质转化和工业应用带来了新的希望。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，通过在 50 - 70℃的 LB 肉汤中培养土壤样本，分离出嗜热和耐热细菌，再利用刚果红染色法筛选出木聚糖酶产生菌。接着，运用 PCR 技术从嗜热脂肪地芽孢杆菌 NASA267 中克隆出木聚糖酶基因 xyl267，并将其连接到 PTZ57R/T 载体，转化到大肠杆菌 DH5α 中。为了实现 xyl267 在大肠杆菌中的异源过表达，研究人员构建了携带该基因的表达质粒，并利用 SDS - PAGE 和酶谱分析检测其表达和活性。此外，还借助生物信息学工具对 xyl267 进行序列分析、结构建模以及理化性质预测。

研究结果如下：

1. 菌株筛选与基因克隆：在从埃及和沙特阿拉伯采集的 226 个菌株中，NASA267 表现出最高的木聚糖酶产量，经 16S rRNA 测序鉴定为嗜热脂肪地芽孢杆菌。研究人员成功克隆了 xyl267 基因，该基因与 Geobacillus sp. Y412MC52 的完整基因组中编码内切 - 1,4 - β - 木聚糖酶的序列具有 97.41% 的同一性。
2. 异源表达与优化：xyl267 基因在大肠杆菌中成功表达，通过优化诱导时间和细胞裂解方法，发现 42℃诱导 4 小时后酶活性最高，达到 40 U/ml，且超声处理 1 分钟是释放重组木聚糖酶的最有效方法。
3. 结构与理化性质：xyl267 属于 GH10 木聚糖酶家族，具有典型的 TIM 桶状折叠结构，活性位点由 Glu134 和 Glu241 构成。其预测分子量为 38.65 kDa，理论等电点（pI）为 5.76，呈酸性。该酶具有较高的脂肪族指数（81.9）和负的 GRAVY 值，表明其具有良好的亲水性，但稳定性较低。
4. 酶学特性：xyl267 的最适温度为 65℃，在 35 - 50℃下稳定性良好，在 60℃下可保持完全稳定，80℃时半衰期为 8 分钟。其最适 pH 为 8，在碱性条件下稳定性较高。此外，该酶在多种盐、溶剂和阳离子存在的情况下仍能保持活性，但 Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和甲醇会抑制其活性。
5. 农废糖化效果：在对多种农业废弃物进行糖化实验时，预处理后的香蕉皮产生的还原糖最多，达到约 176 mg/L，而稻草产生的还原糖最少，仅为 58 mg/L。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功分离、表征和表达了来自嗜热脂肪地芽孢杆菌 NASA267 的耐热木聚糖酶 xyl267。xyl267 在高温和碱性条件下表现出良好的活性和稳定性，这使其成为生物燃料、纸张和食品加工等行业中极具吸引力的候选酶。尽管在高温下其活性会有所下降，但在 pH 8 - 8.5 的范围内，该酶的性能进一步支持了其在工业中的可行性。此外，该酶在多种盐、溶剂和某些金属存在的环境中仍能保持稳健的活性，显示出其对不同加工环境的适应性。在农废糖化方面，xyl267 能够有效水解预处理后的香蕉皮，释放出大量可发酵糖，为生物质转化提供了新的途径。然而，对于像稻草这样富含木质素的材料，还需要进一步优化底物预处理和反应条件，以提高 xyl267 的性能。总体而言，这项研究为重组木聚糖酶在工业生物技术中的应用提供了宝贵的见解，为未来大规模生产和应用奠定了基础。