鼻内递送工程化细胞外囊泡：创伤性脑损伤治疗的新希望

《Journal of Nanobiotechnology》：Intranasal delivery of engineered extracellular vesicles promotes neurofunctional recovery in traumatic brain injury

研究人员针对创伤性脑损伤（TBI）治疗难题，开展工程化细胞外囊泡（EEVs）研究，发现其可促进神经功能恢复，为 TBI 治疗提供新策略。

　　创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury，TBI）就像隐藏在生活中的 “暗箭”，随时可能给人们带来巨大的伤害。它是导致成年人残疾的主要原因之一，严重影响患者的生活质量。目前，针对 TBI 的治疗面临着诸多困境，比如还没有专门的药物得到美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。在 TBI 发生时，大脑的细胞屏障被破坏，炎症因子不断释放，引发一系列 “蝴蝶效应”，像神经元凋亡、坏死、纤维化等问题接踵而至，让大脑的 “小宇宙” 陷入混乱。而且，过度的炎症反应会进一步加重中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）的损伤。因此，寻找有效的治疗策略迫在眉睫。

为了攻克这一难题，来自北京协和医院、中国医学科学院基础医学研究所等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们将研究聚焦在细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）上，这些小小的囊泡就像细胞间的 “快递员”，携带各种物质，在细胞通讯中发挥着重要作用。研究人员通过一系列操作，构建了工程化细胞外囊泡（EEVs），并探究其对 TBI 的治疗效果。该研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上。

在研究方法上，研究人员首先从健康志愿者的脂肪组织中分离出人类脂肪来源的间充质干细胞（human Adipose - Derived Mesenchymal Stem Cells，hADSCs），并对其进行培养。接着，利用超速离心、超滤等技术分离和纯化 EVs。为了深入了解 EVs 的作用机制，他们运用了高通量 miRNA 测序技术，筛选出与 NF-κB 信号通路相关的 miRNA。然后，通过构建慢病毒载体，将筛选出的 miRNA 和超小顺磁性纳米颗粒（Ultra - Small Paramagnetic Nanoparticles，USPN）整合到 EVs 中，制备出 EEVs。在动物实验方面，建立了 TBI 大鼠模型，并采用鼻内给药的方式给予不同处理，通过行为学测试、免疫荧光、蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）等多种技术对实验结果进行检测和分析。此外，还利用人类诱导多能干细胞（human - induced pluripotent stem cells，hiPSCs）构建了脑类器官模型，进一步验证 EEVs 的治疗效果。

研究结果如下：

1. EVs 改善 TBI 大鼠神经功能：研究人员发现，连续鼻内给予 EVs 能显著改善 TBI 大鼠的神经功能。通过改良神经功能缺损评分（mNSS）、足失误测试、转棒测试和圆柱测试等行为学评估发现，与给予磷酸盐缓冲液（PBS）的对照组相比，接受 EVs 治疗的大鼠在多个测试指标上都有明显改善，表明 EVs 治疗能有效促进 TBI 后的神经功能恢复。
2. EVs 抑制 NF-κB 信号通路减少小胶质细胞激活：免疫荧光分析显示，鼻内给予的 PKH67 标记的 EVs 主要被小胶质细胞（IBA1）和神经元（NeuN）摄取。进一步研究发现，与 PBS 和 hADSC 组相比，EVs 治疗能显著抑制小胶质细胞的激活，降低炎症因子如白细胞介素 - 1β（IL-1β）、诱导型一氧化氮合酶（INOS）的表达，同时增加精氨酸酶 1（ARG1）的表达。Western blot 分析表明，EVs 治疗可降低 NF-κB 信号通路蛋白（P-NF-κB 和 NF-κB）的表达水平，说明 EVs 通过抑制 NF-κB 信号通路来减少小胶质细胞的激活。
3. 鉴定出 EVs 中靶向 NF-κB 通路的 miRNA：高通量 miRNA 测序分析揭示了 20 种在样本中一致上调的 miRNA。通过转染实验和 qRT-PCR 分析，发现 hsa-miR-21-5p、hsa-miR-29a-3p 和 hsa-miR-146a-5p 能有效抑制小胶质细胞的激活，降低促炎细胞因子的表达。免疫荧光和 Western blot 分析进一步证实，这三种 miRNA 可抑制 NF-κB 信号通路。
4. 构建靶向损伤部位的 EEVs：为了探索这三种 miRNA 在 TBI 病理过程中的作用，研究人员构建了靶向损伤部位的 EEVs。将含有这三种 miRNA 的慢病毒载体转染 hADSCs，并在培养过程中加入 USPN，成功制备出 EEVs。实验结果显示，EEVs 具有良好的靶向能力，能有效定位于 TBI 损伤部位。
5. EEVs 促进 TBI 大鼠神经功能恢复：在 TBI 大鼠模型中，给予 EEVs 治疗后，通过行为学测试发现，与 EVs 治疗组相比，EEVs 治疗组的大鼠在 mNSS 评分、足失误次数、转棒测试的跌落潜伏期以及前肢使用对称性等方面都有更显著的改善，表明 EEVs 能更有效地促进 TBI 后的神经保护和神经功能恢复。
6. EEVs 增强 TBI 后大脑可塑性和神经发生：通过高尔基染色和体外划痕实验，研究人员发现 EEVs 治疗能显著增加 TBI 大鼠神经元的树突棘密度、分支数量和总树突长度，促进神经元的迁移和再生，增强大脑的可塑性和神经发生，有助于改善 TBI 后的神经功能恢复。
7. EEVs 减少神经元凋亡：EEVs 和 EVs 治疗都能显著降低 TBI 大鼠损伤周围区域多种炎症细胞因子的表达水平，EEVs 的效果更优。ELISA 分析显示，EEVs 治疗组脑脊液中 IL-1β 和 IL-6 的浓度明显降低。组织病理学分析表明，EEVs 治疗可减少 CD68 阳性小胶质细胞的数量，降低神经元凋亡率，保护神经元，减轻脑损伤。
8. EEVs 对脑类器官具有保护作用：在人类脑类器官模型中，建立脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症模型并给予 EEVs 治疗。结果显示，与 LPS 和 LPS_EVs 组相比，LPS_EEVs 组炎症细胞因子的表达水平显著降低，INOS 表达明显减少，表明 EEVs 能有效减轻脑类器官中的神经炎症。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功开发了结合鼻内给药和磁性靶向的 EEVs，能将靶向 NF-κB 信号通路的 miRNA 高效递送至大脑损伤部位。EEVs 可有效抑制神经炎症，增强神经可塑性，显著改善 TBI 后的神经功能，在人类脑类器官模型中也展现出强大的保护作用。然而，该研究也存在一些局限性，如行为实验样本量较小，可能增加假阳性结果的风险；磁性靶向在临床应用中的安全性和长期疗效还需要进一步研究。尽管如此，这项研究为 TBI 的治疗提供了新的策略和方向，未来有望通过优化技术、扩大样本量和开展临床试验，推动 EEVs 在临床治疗中的应用，为 TBI 患者带来新的希望。