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为探究植物免疫基因调控中可变剪接的机制，研究人员对拟南芥进行转录组分析，发现 CPL3 影响 DGK5 可变剪接，调节植物免疫和磷脂酸稳态。
在植物的世界里，为了抵御病原体的入侵，它们进化出了一套独特的免疫防御机制。当细菌的鞭毛蛋白等微生物相关分子模式（MAMPs）出现时，植物细胞表面的模式识别受体（PRRs）就像 “侦察兵” 一样，迅速识别并启动一系列免疫反应，其中就包括模式触发免疫（PTI） 。在这个过程中，磷脂酸（PA）作为一种重要的第二信使，参与了多个细胞信号传导事件，而二酰甘油激酶 5（DGK5）则在 PA 的产生中发挥着关键作用。
然而，在植物免疫基因调控的复杂网络中，前体 mRNA 的可变剪接（AS）虽被认为是增强基因表达可塑性以适应环境的重要机制，但它在植物免疫基因调控中的精确调控和功能却一直是个未解之谜。为了揭开这个谜团，来自美国密歇根大学、德克萨斯农工大学以及英国詹姆斯赫顿研究所的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Genome Biology》上。
研究人员采用了高深度转录组分析技术，结合差异表达、差异可变剪接和差异转录本使用分析，对拟南芥进行了研究。他们以微生物模式 flg22 肽处理拟南芥野生型（WT）Col-0 和 cpl3-3 突变体，通过 Illumina HiSeq 2500 平台进行 RNA 测序，每个样本平均获得 1.2 亿个 150bp 长的双端测序读段，实现了对拟南芥转录组约 530 倍的覆盖。
研究结果如下：
- 深入分析 flg22 处理后的可变剪接事件：通过对 RNA 测序数据的分析，研究人员发现 flg22 处理诱导了拟南芥基因表达和可变剪接模式的显著改变。在 40932 个基因中，有 4260 个基因（10.4%）被确定为 flg22 调控的差异表达基因（flg22-DEGs），642 个基因（1.6%）为 flg22 调控的差异可变剪接基因（flg22-DASs），对应的有 980 个 flg22 调控的差异转录本使用（flg22-DTUs） 。基因本体（GO）富集分析表明，flg22-DASs 中与免疫相关的术语显著富集，如对细菌的反应、防御反应的调节和免疫系统过程等。
- CPL3 在 flg22 诱导的可变剪接动态中的重要作用：研究发现，RNA 聚合酶 II C 末端结构域磷酸酶样 3（CPL3）在 flg22 诱导的可变剪接事件中起着关键调节作用，且其对可变剪接的调节独立于基因表达水平。在 cpl3-3 突变体中，约 50% 的 flg22-DASs 与 WT 不同，这表明 CPL3 对可变剪接的影响更为显著。此外，CPL3 对不同类型的可变剪接事件，如可变 3' 剪接（A3S）、可变 5' 剪接（A5S）、内含子保留（IR）和外显子跳跃（ES）均有影响，尤其在 IR 事件中作用突出。
- CPL3 对 DGK5 转录和可变剪接的调控：PA 生物合成基因 DGK5 也发生了 CPL3 依赖的可变剪接事件。DGK5 转录产生两种主要异构体 DGK5β 和 DGK5α ，两者都可被多种 MAMPs 诱导，且部分依赖于 CPL3。CPL3 负调控 DGK5 的表达，在 cpl3-3 突变体中，flg22 诱导的 DGK5 表达更高。
- DGK5α 的功能缺陷：DGK5α 缺乏钙调蛋白结合结构域（CBD），其催化活性和 PA 生成能力显著降低，且不能与上游激酶 BIK1 相互作用并被其磷酸化。在植物免疫实验中，DGK5α 无法恢复 dgk5-1 突变体中 flg22 诱导的 ROS 产生缺陷，也不能增强对致病和非致病细菌感染的抗性，而 DGK5β 则可以。
研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了拟南芥在 MAMP flg22 处理后的可变剪接景观，明确了 CPL3 在调节 flg22 触发的可变剪接景观中的重要作用，以及不同 DGK5 可变剪接异构体在维持 PA 稳态和调节植物免疫中的意义。这不仅加深了人们对植物免疫基因调控机制的理解，也为未来进一步研究植物免疫提供了重要的理论基础。同时，研究还表明，可变剪接和基因表达的调控在植物免疫反应中可能是相对独立的过程，共同协调以实现强大而平衡的免疫反应。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：
- RNA 测序（RNA-seq）：对拟南芥野生型和 cpl3-3 突变体在 flg22 处理前后进行 RNA 测序，获得转录组数据，用于分析基因表达和可变剪接情况。
- 3D RNA-seq 分析：利用该分析方法识别差异表达基因（DEGs）、差异可变剪接基因（DASs）和差异转录本使用（DTUs）。
- 体外激酶实验：用于检测 DGK5α 和 DGK5β 的催化活性以及 BIK1 对它们的磷酸化作用。
- 蛋白免疫印迹（WB）：检测蛋白表达水平，如检测 DGK5β 和 DGK5α 蛋白的表达。
- 病原体感染实验：用致病和非致病细菌感染拟南芥，评估不同 DGK5 异构体对植物免疫的影响。
