综述：3D 模型在骨愈合中的作用

《Cell Regeneration》：Revolutionizing bone healing: the role of 3D models

骨组织工程（BTE）中，3D 模型在研究骨再生方面优势显著，助力骨疾病治疗。

　　

骨疾病现状与研究方向

随着人们寿命的延长，急慢性骨疾病的发病率呈上升趋势。每年有超 2000 万人遭受骨组织损失，约 10% 的骨折无法正常愈合。像骨肉瘤、骨质疏松、骨软化症、骨髓炎、缺血性坏死和萎缩性骨不连等疾病，会严重阻碍骨再生进程。因此，骨异常的重建仍是临床上的一大难题。骨组织工程（BTE）这一创新学科应运而生，它旨在利用生物材料开发三维（3D）支架，模拟骨组织的自然环境，从而提高骨缺损的再生能力，减少发病率，保障损伤愈合。

体外培养模型的演变

传统的二维（2D）体外模型在研究骨生理和病理过程以及评估药物疗效方面存在诸多局限。例如，它难以准确模拟细胞间的相互作用和骨微环境的复杂性。在过去，临床前骨研究主要采用 2D 的成骨细胞、成骨细胞前体、间充质干细胞（MSCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）、永生细胞系和恶性细胞系的原代培养来重建骨微环境。然而，永生细胞无法代表正常成骨细胞的全部表型，长期传代还会导致表型异质性；癌细胞则存在典型的肿瘤异常和遗传漂变等问题。

相比之下，3D 细胞培养模型展现出了独特的优势，包括更高的细胞存活率、与体内相似的形态以及更好的细胞 - 细胞和细胞 - 细胞外基质（ECM）相互作用。其中，细胞球状体和 3D 骨类器官等模型在研究骨再生方面具有重要价值。

微流控技术作为一种新兴的细胞培养技术，借助微纳制造技术的进步，能够创建模拟体内环境的复杂微结构。微流控芯片或芯片实验室设备提供了明确且可控的微环境，确保细胞培养的理想性、可重复性和可控性，为骨再生研究带来了新的机遇。

各类骨细胞模型的特点

生物材料是所有 3D 模型的基础，为细胞生长提供物理支持，模拟细胞外基质。像羟基磷灰石和胶原蛋白等生物材料，常被用于促进细胞向成骨细胞分化。但生物材料无法完全模拟生物动力学和生理反应，不太适合研究复杂的细胞相互作用和疾病模型。

Transwell 和共培养系统能让不同细胞类型相互作用，模拟体内骨微环境的物理和化学信号。它们常与生物材料结合，增强细胞粘附和细胞间相互作用，支持球状体和类器官模型，增加微环境的复杂性。不过，这些系统在模拟细胞相互作用方面存在一定局限，无法提供更先进系统所具备的完全三维性和流动动力学。

骨球状体是简单的三维结构，能模拟骨组织的细胞 - 基质相互作用和 ECM 合成。生物材料可提高球状体的稳定性和机械性能，使其更接近真实骨组织。球状体还可与共培养系统结合，研究不同细胞类型的相互作用。与类器官相比，球状体结构相对简单，无法复制血管形成或骨代谢等特定功能，但它更易制备，为不太复杂的实验提供了通用平台。

骨类器官是更复杂的模型，不仅能模拟骨结构，还能模拟骨的再生和代谢等功能。它需要更先进的生物材料来确保稳定适宜的微环境，可与其他细胞类型共培养，模拟复杂的细胞间相互作用，如成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用。虽然类器官更难创建，但它能更真实地模拟体内条件。不过，与芯片上的模型不同，类器官没有整合动态流动。

球状体 - 芯片模型结合了球状体和微流控技术，能够模拟体内骨环境的动态流动和机械应力，为研究营养物质、化学信号和机械应力对骨形成和再生的影响提供了先进平台。

器官 - 芯片模型是最先进的模型，它结合了类器官和微流控技术，既能模拟骨环境的三维结构，又能模拟动态流动，可复制骨形成、代谢以及与其他组织（如神经支配或血管化）的相互作用。但该模型需要复杂的生物材料来维持其稳定性和完整性，创建成本高且技术复杂。

骨的结构与组织

骨是一种高度有序、动态且代谢活跃的组织，由有机基质和羟基磷灰石矿物质相组成。有机基质包含脂质、胶原蛋白、非结构蛋白和糖胺聚糖等。

骨细胞主要分为成骨细胞、骨细胞、骨衬里细胞、前成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞负责骨基质蛋白的合成、沉积和形成；骨细胞是被困在骨基质小腔（称为骨陷窝）中的成熟成骨细胞；骨衬里细胞是覆盖在骨表面的扁平细长成骨细胞，缺乏合成功能；前成骨细胞是成骨细胞的间充质细胞前体；破骨细胞是负责骨吸收的大型多核细胞，其前体是单核造血细胞 。

β - 转化生长因子（TGF - β）和骨形态发生蛋白（BMPs）的信号通路对骨重塑过程起着关键作用，它们控制着成骨细胞和破骨细胞的功能，同时也调节着 hMSCs 的分化。

骨组织在受损后以及正常细胞更新过程中都能自我再生，以维持结构完整性和功能。骨折修复是一个典型的再生过程，可分为炎症、纤维软骨痂形成、矿化骨痂形成和重塑四个重叠阶段。

用于 2D 体外模型的细胞

临床前骨研究的 2D 模型大多使用哺乳动物细胞培养。单层细胞培养成本低、易于维护，分析方法简单且可重复、标准化。成骨细胞是骨中的主要细胞类型，常被用于研究。此外，干细胞、恶性细胞系和永生细胞也被用于构建体外研究模型 。

供体的分离部位、性别和年龄会影响原代骨细胞的活性。例如，老年人、绝经后妇女以及股骨头等特定骨部位的成骨细胞增殖会减少。

成骨细胞系可从肿瘤骨组织（如骨肉瘤）中分离得到，虽然这些细胞保留了成骨潜能，但存在异倍体诱导的遗传漂变和肿瘤细胞特征性异常等缺点。

目前，研究骨再生治疗的最佳体外模型是人类干细胞。成人干细胞（ASCs），包括 iPSCs 和人类间充质干细胞（hMSCs），被证明是优秀的成骨祖细胞，有助于伤口愈合和骨修复。

iPSCs 可通过重编程人类成纤维细胞并诱导其向成骨细胞分化获得，但这一过程复杂、成本高、耗时且重编程效率低，还可能导致基因表达改变。

hMSCs 因其旁分泌活动而备受关注，它能分泌多种细胞因子和趋化因子，具有免疫调节、抗凋亡和抗氧化等作用。hMSCs 分化为成骨祖细胞的能力受 Runt 相关转录因子 2（Runx2）和 Osterix（Sp7）的调控，这两个转录因子控制基因表达，决定成骨细胞表型。碱性磷酸酶（ALP）是早期成骨标记蛋白，在定向成骨祖细胞中表达；骨钙素（OCN）、骨连接蛋白（SPARC）和骨桥蛋白（OPN）则由成熟成骨细胞表达。

hMSCs 可从多种成人和胎儿组织中分离得到，临床实践中最常用的是从脂肪组织（hADSCs）和骨髓（hBMSCs）中分离的 hMSCs。hADSCs 产量高、易于获取，是异基因移植的理想候选细胞；hBMSCs 具有免疫调节、多能性和抗炎等特性，还能促进血管生成和协助造血。

骨组织工程中的生物材料

BTE 的目标是生产可植入的移植物，利用骨的自然再生能力治疗创伤、癌症和其他骨疾病。支架提供的物理微环境与骨细胞所处的天然 3D 微环境相似，生物材料的成分及其组装技术决定了支架的机械性能、几何形状和孔隙结构等属性，这些属性可被调整以调节其成骨潜能。

理想的骨移植材料应具备良好的生物相容性、骨传导性、骨诱导性、生物可降解性以及与骨相似的机械特性。

陶瓷材料具有良好的生物相容性，如羟基磷灰石（HA）和磷酸三钙（TCP），它们因成骨特性和与宿主骨连接的能力而受到广泛应用。双相磷酸钙（CaP）是一种常见的合成陶瓷，由 TCP 和 HA 按不同比例组合而成，可增强各矿物质的特性。研究发现，在磷酸钙（CaP）基生物材料中添加阳离子（锶 Sr²⁺和镁 Mg²⁺）可改变其微观结构、溶解度和结晶度等理化性质，提高机械性能。

聚合物基生物材料可分为合成聚合物和天然聚合物。天然聚合物如胶原蛋白（Coll）、壳聚糖（CS）、海藻酸盐（Alg）和透明质酸（Hay），因其生物相容性和与 ECM 的相似性而用于骨再生。但纯胶原蛋白缺乏机械强度，常与陶瓷生物材料结合使用。CS 具有抗菌性、适宜细胞生长的多孔结构，能刺激成骨细胞和间充质细胞增殖以及体内血管生成；Alg 的多孔结构可刺激血管化、氧合、细胞迁移、粘附和增殖；高分子量透明质酸（1900kDa）可通过刺激血管生成和促进损伤骨区域的 MSC 更快分化来显著促进骨形成。

合成聚合物如聚（ε - 己内酯）（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚（DL - 乳酸 - 共 - 乙醇酸）共聚物（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等在 BTE 中也有应用。PCL 获得了 FDA 批准，生物相容性高；PLA 和 PGA 的抗压强度和骨传导性有限，不太适合作为骨组织重建的生物材料；PLGA 共聚物则通过调整 PLA 和 PGA 的比例来提高骨传导性和溶解性，但合成聚合物在降解过程中会产生酸性产物，可能影响局部微环境的 pH 值。

复合生物材料由陶瓷支架与聚合物整合而成，具有良好的生物相容性和机械硬度，适用于组织工程应用。以胶原蛋白和羟基磷灰石为基础的复合材料（COLL/HA）在骨移植中效果显著，研究表明其对 hBMSCs 具有良好的骨诱导性和生物相容性。

此外，一些支架还常被用作药物递送系统。COLL/HA 复合材料可通过添加各种成分（如骨形态发生蛋白、双膦酸盐、抗生素和抗癌药物等）来实现多功能特性。

除了上述固体、刚性或多孔的生物材料，它们还可构建成水凝胶。水凝胶是由亲水性聚合物组成的三维网络，能保留大量水分，常被用于模拟自然生物环境，促进细胞生长、营养物质扩散和生化信号传递。水凝胶广泛应用于构建三维模型（如球状体和类器官）以及药物递送系统。

Transwell 和共培养骨细胞

单种细胞培养虽可研究细胞形态、分子过程和分化模式，但无法识别不同细胞类型之间的信号。共培养模型更接近体内环境，不同细胞类型之间的相互作用可通过连接、外泌体和自分泌 / 旁分泌活动传递细胞间信号，有助于深入理解紧密的细胞间相互作用。

共培养系统面临一些挑战，如选择适合两种或多种不同细胞类型共存的参数（细胞关系、共享培养基、培养时间和区分不同细胞亚型的工具等）。

2D 共培养有直接和间接物理接触两种方式。直接接触共培养可研究物理相互作用和自分泌 / 旁分泌信号，但难以完全理解不同细胞在同一环境中的不同贡献。间接细胞共培养中，不同细胞类型通过 Transwell 多孔膜物理分离，培养基和其他分子可在不同容器间流动，细胞通过旁分泌信号相互影响。

许多研究表明，共培养能显著影响细胞的功能和行为。例如，Taylor 等人共培养成骨细胞和骨细胞，发现间隙连接细胞间通讯在成骨细胞对骨细胞给予的机械刺激的反应中起关键作用；Suda 等人强调成骨细胞和破骨细胞协作的必要性；Chen 等人研究发现共培养在促进钙磷水泥（CPC）的成骨和血管生成方面比单独培养更具优势。

骨球状体

骨球状体作为一种有前景的 3D 模型，能在体外提供类似组织的理化环境。其高 ECM 合成和细胞 - ECM 相互作用使其成为研究骨及其生物学过程的有用模型，这些相互作用可调节基因表达、细胞增殖、分化，并有助于细胞骨架与细胞外环境之间的信号转导。

球状体的形成过程与胚胎发生、形态发生和器官发生的自然组装过程相似，细胞 - 细胞和细胞 - ECM 相互作用由钙粘蛋白和整合素介导，对细胞聚集体的形成和维持至关重要。

球状体的形成包括多个步骤：首先，悬浮的单个细胞聚集形成松散锚定的细胞球；ECM 纤维促进初步聚集，其与外周细胞表面的整合素结合；接着，E - 钙粘蛋白通过形成外周细胞钙粘蛋白之间的同源相互作用，刺激初始细胞聚集的牢固粘附；β - 连环蛋白促进细胞信号传递；肌动蛋白则影响相邻细胞间的相互作用，促进聚集和干细胞特性的维持，最终形成紧密粘附的多细胞球状体。

球状体在研究中也面临一些挑战，如血管生成和营养吸收问题。内部细胞无法像外部细胞那样获得持续的营养和氧气输入，随着聚集体尺寸增加，营养物质向内部的扩散变得更加困难，因此尺寸控制是关键因素之一。此外，球状体的环境（如所用材料、分子或刺激）也会影响其特性。

目前有多种技术用于球状体的形成，包括沉淀培养、液体覆盖培养、悬滴培养和磁悬浮培养。沉淀培养利用离心力使细胞聚集在管底，再将细胞沉淀重悬于球状体形成培养基中培养；液体覆盖培养通过在非粘附培养板上阻止细胞粘附来形成球状体；悬滴培养利用表面张力和重力的共同作用，将细胞悬液滴在倒置的微孔板上形成球状体；磁悬浮培养则是在细胞生长过程中加入磁性粒子，使细胞在磁场作用下悬浮，促进细胞间接触和聚集。

球状体常被植入生物材料中以稳定聚集体和形状，水凝胶、生物膜和颗粒等都可作为球状体生产的支撑结构。水凝胶因其类似 ECM 的特性，是封装球状体的理想材料，可减少细胞凋亡，提高细胞活力，维持骨分化潜能并刺激促血管生成因子的分泌；生物膜的成分比例对细胞粘附、增殖以及球状体的形成大小和速率有重要影响；颗粒可调节球状体的微环境，但可能抑制相邻细胞间的内部连接，影响细胞分化，而释放分化和生长因子的颗粒可解决这一问题，促进骨分化。

用于骨研究的球状体 - 芯片

微流控技术和微纳制造技术为球状体的形成提供了有力工具。微流控芯片能精确控制微尺度下的流体流动，对球状体的空间分布和时间动态进行调控，便于研究细胞间相互作用和创建复杂的细胞结构。

在骨生成过程中，模拟体内血管化的动态培养基流动至关重要，它不仅能持续提供营养物质和清除细胞代谢废物，还能诱导流体机械刺激、矿化和 ECM 沉积，促进骨再生。

利用微流控芯片控制动态细胞培养，在 3D 骨细胞球状体形成方面取得了显著进展。研究表明，与静态条件相比，基于微流控芯片的动态培养环境可提高骨细胞球状体的矿化程度和活力，且该结果在小鼠和人类原代前成骨细胞来源的球状体中均得到验证。此外，微流控芯片还可与生物传感器和分析技术结合，测量各种参数，如氧气水平。例如，使用氧气渗透培养芯片（Oxy 芯片）可避免球状体核心缺氧，促进 MSCs 向成骨细胞分化。

骨类器官

骨类器官是一种 3D 细胞培养系统，由干细胞或器官祖细胞自组织形成类似组织和器官的结构，广泛应用于分化研究、药物开发、药理学应用、癌症研究以及基因和蛋白质表达研究等领域。

骨类器官是研究骨再生机制的有利模型，它能模拟骨组织的空间组织和功能。干细胞、基质支架和机械刺激是保证骨类器官生长和分化的基本要素。骨类器官中常用成骨细胞、破骨细胞和干细胞，多种细胞类型共培养能更好地复制人类骨组织的生理和病理过程，包括自我更新、迁移和分化等。

iPSCs 来源的类器官根据发育过程构建，通常处于胚胎阶段，更适合研究早期器官的生物学和生理学。虽然构建骨类器官面临诸多挑战，但已有大量 iPSC 来源的骨类器官被用于骨修复研究。例如，O’Connor 等人用小鼠 iPSCs 构建骨类似物，研究骨与软骨之间的关系。

ASCs 通常分化为特定的组织或器官细胞，产生由一种细胞组成的类器官。BM - MSCs 广泛用于生成骨类器官，Scotti 等人利用胶原蛋白支架和 BM - MSC 构建了软骨内成骨类器官模型，并通过添加 IL - 1β 促进组织重建，该类器官可进行血管生成、造血和骨修复等生理过程。

生物活性材料是稳定骨类器官生产的关键组成部分。Matrigel 是一种常用的类器官培养工具，它是 Engelbreth - Holm - Swarm 小鼠肉瘤基底膜的可溶性提取物，能提供模拟自然细胞外基质的生物学和三维基础，含有多种生长因子，可刺激细胞附着和增殖。但 Matrigel 存在动物来源、批次间差异大等问题，限制了其应用。

水凝胶是一种有前景的替代材料，可设计具有特定化学和物理特性，为细胞培养提供更好的调控环境。水凝胶由天然或合成聚合物组成，如多糖和蛋白质（如胶原蛋白、明胶、壳聚糖和<