人诱导多能干细胞来源的中性粒细胞展现强大抗菌效力

《Cell Regeneration》：Human induced pluripotent stem cells derived neutrophils display strong anti-microbial potencies

为解决中性粒细胞功能障碍问题，研究人员开展 iNEUs 研究，发现其有强抗菌效力，意义重大

　　在人体的免疫防线中，中性粒细胞（Neutrophils）堪称抵御微生物感染的 “先锋部队”，它是固有免疫防御系统的关键组成部分，在维持免疫平衡方面也发挥着重要作用。然而，化疗、放疗以及血液系统疾病等常常会引发中性粒细胞功能障碍，像中性粒细胞减少症（neutropenia），这不仅会导致严重感染，还可能引发自身免疫性疾病和癌症等健康问题 。

当前，中性粒细胞输血是治疗中性粒细胞减少症患者的一种潜在方法，尤其是对于那些感染了耐药菌的患者而言。但在实际临床应用中，要获取足够数量且功能正常的中性粒细胞极为困难，这大大限制了中性粒细胞治疗的临床进展。

为了突破这一困境，中国科学院广州生物医药与健康研究院的研究人员展开了深入研究。他们聚焦于人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs），期望借助其独特的无限自我更新和多能性，分化产生可用于输血治疗的中性粒细胞。研究成果发表在《Cell Regeneration》上。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞培养与诱导分化方面，他们对 hiPSCs 进行培养，并通过特定的诱导条件使其分化为造血干细胞 / 祖细胞（hiPSCs derived hematopoietic stem/progenitor cells，iHSPCs），随后进一步诱导 iHSPCs 分化为中性粒细胞（hiPSCs derived neutrophils，iNEUs）。在细胞特性分析技术上，利用流式细胞术（Flow cytometry）、Wright-Giemsa 染色、吞噬试验（Phagocytosis assay）等多种实验技术，对 iNEUs 的细胞表面标志物、形态、抗菌功能等进行了全面深入的分析。动物实验模型构建方面，建立了中性粒细胞功能受损的小鼠模型，通过向这些小鼠输入 iNEUs，观察其在感染不同细菌后的生存情况和健康状况变化。

下面来看看具体的研究结果：

• iNEUs 的生成：研究人员采用了一种明确且可扩展的方法，从 hiPSCs 成功生成了 iNEUs。首先，hiPSCs 通过典型的内皮 - 造血转化（endothelial-hematopoietic-transition，EHT）过程生成 iHSPCs，在此过程中，可持续收集悬浮的 iHSPCs。接着，将收集到的 iHSPCs 在含有髓系细胞因子 G-CSF 和 IL3 的培养基中培养，经过一段时间的分化，约 90% 的细胞表达中性粒细胞相关标志物 CD15 和 / 或 CD16，且 iNEUs 呈现出典型的中性粒细胞形态，如分叶核，同时其他与中性粒细胞功能相关的表面标志物，如 CD66b、CD62L 等也在 iNEUs 中良好表达。经计算，从一定数量的 hiPSCs 起始培养，可获得大量的 iHSPCs 和 iNEUs。
• iNEUs 具有典型中性粒细胞特征：在抗菌功能方面，iNEUs 表现出色。其吞噬能力与从人外周血分离的原发性中性粒细胞（PB-NEUs）相当，甚至更优，能够有效吞噬 PE 标记的珠子；在受到佛波酯（PMA）刺激时，iNEUs 会产生活性氧（ROS）并发生氧化爆发，尽管程度较 PB-NEUs 稍弱；在趋化迁移实验中，iNEUs 对胎牛血清（FBS）表现出良好的趋化性，与 PB-NEUs 相近；同时，iNEUs 在 PMA 刺激下能够形成典型的中性粒细胞胞外陷阱（NETs），且其大小与 PB-iNEUs 相当。此外，当受到脂多糖（LPS）刺激时，iNEUs 会诱导表达重要的细胞因子。
• iNEUs 在转录组上更接近 PB - 中性粒细胞而非巨噬细胞：通过对 iNEUs、PB - 中性粒细胞以及 M1 或 M2 型 PB - 巨噬细胞进行 RNA 测序（RNA-seq）分析发现，iNEUs 的转录组与 PB - 中性粒细胞聚集在一起，而与巨噬细胞差异较大。与 PB - 巨噬细胞相比，iNEUs 中上调的基因富集在典型的中性粒细胞功能相关通路；与 PB - 中性粒细胞相比，iNEUs 中上调的基因则富集在活跃的生物合成功能相关通路，这表明干细胞分化而来的 iNEUs 比成熟的 PB - 中性粒细胞具有更强的增殖能力。
• iNEUs 对不同细菌具有强大的抗菌效力：研究人员通过生物发光标记杀伤试验和 CFU 形成试验，对 iNEUs 针对不同细菌的抗菌功能进行了检测。结果显示，iNEUs 对肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、大肠杆菌（E.coli）等革兰氏阴性菌以及金黄色葡萄球菌（S.aureus）等革兰氏阳性菌都具有强大的抑制和杀伤能力。
• iNEUs 输血可保护中性粒细胞功能受损小鼠免受致命感染：在动物实验中，研究人员首先通过腹腔注射抗 Ly6G 抗体使 BALB/c 小鼠的中性粒细胞功能受损，模拟中性粒细胞减少症。随后，给这些小鼠腹腔或静脉注射不同细菌，并同时输入 iNEUs 或 PBS 作为对照。结果发现，输入 iNEUs 的小鼠在感染不同细菌后的生存率显著提高，体温和体重下降得到缓解，整体健康状况明显改善。例如，在感染肺炎克雷伯菌的实验中，对照组小鼠在 24 小时内全部死亡，而 iNEUs 输血组小鼠在接下来的 14 天内无一死亡。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员开发出一种可生成 iNEUs 的方法，这些 iNEUs 不仅具有典型的中性粒细胞特征，还对多种革兰氏阳性和阴性细菌展现出强大的抗菌效力。在动物实验中，iNEUs 输血能够显著提高中性粒细胞功能受损小鼠在致命细菌感染后的生存率。这一研究成果为治疗中性粒细胞功能障碍相关疾病提供了新的策略和方向，有望为那些面临严重感染风险的患者带来新的希望，同时也为细胞治疗领域开辟了新的道路，未来或许可通过基因编辑等手段进一步优化 iNEUs 的功能，使其更好地应用于临床治疗 。