4 - 乙烯基环己烯二氧化物致小鼠卵巢早衰机制新发现：IGF1R 下调引发过度自噬

《Stress Biology》：The 4-vinylcyclohexene dioxide induced mouse ovarian premature failure is caused by down regulation of IGF1R and triggering excessive autophagy

为探究 4 - 乙烯基环己烯二氧化物（VCD）对卵巢自噬的影响，研究发现其下调 IGF1R 引发过度自噬致卵巢早衰，意义重大。

　　在女性的生殖健康领域，卵巢的正常功能至关重要，它关乎着生育能力以及整体的身体健康。然而，生活中存在许多潜在的 “健康杀手”，4 - 乙烯基环己烯二氧化物（VCD）就是其中之一。VCD 是一种广泛应用于工业的化学物质，大量研究表明它会对卵巢产生毒性，可导致卵泡闭锁、卵巢早衰（POF）等问题，严重影响女性生育功能。此前，虽然已知 VCD 会诱导卵巢毒性，但其具体机制尚未完全明确，尤其是 VCD 对卵巢自噬的影响尚不清晰。为了深入了解这些问题，西北农林科技大学的研究人员开展了相关研究，其成果发表在《Stress Biology》杂志上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：通过构建小鼠模型，给 6 周龄的 C57BL/6 小鼠连续 15 天腹腔注射 VCD，模拟卵巢早衰情况；使用细胞培养技术培养人颗粒细胞样肿瘤细胞系 KGN 细胞，并对其进行 VCD 处理；采用转录组测序（RNA-Seq）分析 VCD 处理前后 KGN 细胞的基因表达变化；利用 Western blot 技术检测相关蛋白的表达水平，从而探究 VCD 影响卵巢功能的分子机制。

研究结果如下：

1. VCD 诱导小鼠 POF 模型的建立：研究人员用 6 周龄 C57BL/6 小鼠构建 POF 模型，连续 15 天注射 VCD 后，通过阴道涂片检测发现小鼠动情周期紊乱，且不同发育阶段的卵泡数量显著减少，血清中雌激素（E?）和抗缪勒管激素（AMH）水平降低，促卵泡生成素（FSH）水平升高。同时，卵巢颗粒细胞（GCs）增殖受抑制、凋亡增加，这些都表明成功建立了小鼠 POF 模型。
2. VCD 下调卵巢 GCs 中 IGF1R 的表达：对注射 VCD 的小鼠卵巢进行研究，发现随着注射时间延长，原始卵泡、初级卵泡和窦状卵泡数量减少，闭锁卵泡数量增加。免疫组化、定量 PCR 和 Western blot 结果均显示，VCD 会下调卵巢 GCs 中胰岛素样生长因子 1 受体（IGF1R）的表达。在体外实验中，用不同浓度 VCD 处理 6 日龄小鼠卵巢和 KGN 细胞，也得到了类似结果，且发现 250 μM VCD 处理可显著降低早期卵泡数量。
3. VCD 抑制 IGF1R/mTOR/AKT 信号通路并诱导卵巢和 KGN 细胞自噬：给小鼠腹腔注射 VCD 5 天后，卵巢免疫荧光和 Western blot 结果显示，VCD 上调自噬标记物 LC3-II、下调 P62，同时抑制 IGF1R 及其下游信号分子 p-AKT 和 p-mTOR 的表达，表明 VCD 抑制 IGF1R/mTOR/AKT 信号通路并诱导卵巢自噬。在 KGN 细胞实验中，用不同浓度 VCD 处理后，发现 500 μM VCD 可激活自噬，且抑制 IGF1R/AKT/mTOR 通路，而加入 AKT 激活剂 SC79 后，可抑制 VCD 诱导的自噬。
4. IGF1R 敲低诱导 KGN 细胞自噬：通过 RNAi 技术敲低 KGN 细胞中 IGF1R 的表达，发现敲低组 GFP-LC3 斑点数量增加，LC3-II 表达上调、P62 表达下调，同时 AKT 和 mTOR 磷酸化水平降低。加入 SC79 后，可逆转这些变化，表明 IGF1R 敲低激活了卵巢 GCs 中的自噬。
5. VCD 激活 KGN 细胞自噬通量：利用 Bafilomycin A1（Baf.A1）检测自噬通量，发现 VCD 单独处理可诱导 GFP-LC3 斑点形成和自噬体与溶酶体共定位，而 Baf.A1 处理会抑制两者共定位。VCD 与 Baf.A1 共处理进一步增强 GFP-LC3 斑点形成，但不促进共定位，且 LC3-II 表达上调，说明 VCD 可诱导高自噬通量。
6. VCD 通过调节自噬相关基因激活 KGN 细胞自噬通量：对 VCD 处理的 KGN 细胞进行转录组测序，发现 1356 个基因上调、2464 个基因下调。分析自噬相关基因后，发现 50 个差异表达基因，包括 22 个上调基因和 28 个下调基因。通过 Western blot 验证，发现 VCD 处理后，NAMPT、ATG4A 表达显著增加，BCL2、ITGB4、BIRC5 表达显著下调，同时 PINK1 表达上调，表明 VCD 可能诱导线粒体自噬（mitophagy）。
7. VCD 诱导的过度自噬通量导致 GCs 功能异常：检测 VCD 处理的 KGN 细胞分泌的 E?水平，发现 VCD 单独处理时 E?水平显著增加，而加入 SC79 激活 AKT 或用 Baf.A1 阻断自噬通量后，E?水平降低。同时，VCD 处理可上调 CYP19A1 表达、下调 WT1 核内表达，而 SC79 或 Baf.A1 处理可逆转这些变化。此外，VCD 处理可促进原始卵泡中 FOXO3a 从细胞核转移到细胞质，表明 VCD 诱导 WT1 选择性降解，导致 GCs 过早分化和原始卵泡过早激活。

研究结论表明，VCD 通过下调 IGF1R 抑制 IGF1R/AKT/mTOR 信号通路，触发卵巢 GCs 过度自噬，进而导致 WT1 选择性降解，促进 CYP19A1 表达和 E?分泌，引发 GCs 过早分化和原始卵泡过早激活，最终导致卵巢卵泡池消耗。该研究揭示了 VCD 致卵巢毒性的新机制，为卵巢早衰的发病机制提供了新见解，也为治疗卵巢早衰提供了潜在的干预靶点，具有重要的理论和临床意义。但研究也存在一定局限性，如 VCD 调节 IGF1R 表达的具体机制以及自噬介导 WT1 降解的详细过程仍有待进一步研究。