从淡水双壳贝类分离出的四环素耐药粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）IFSMLMEK1 基因组解析

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Genome sequence of prodigiosin-producing and tetracycline-resistant Serratia marcescens (IFSMLMEK1), identified from a freshwater bivalve Lamellidens marginalis

来自印度的研究人员对淡水双壳贝类中分离的粘质沙雷氏菌 IFSMLMEK1 研究，揭示其耐药机制与基因组特征。

　　多药耐药的粘质沙雷氏菌（Serratia）对医疗保健和水产养殖构成日益严峻的挑战。在印度，粘质沙雷氏菌已被确认为与淡水观赏鱼相关的病原体。2024 年 6 月，研究人员从西孟加拉邦一处污水灌溉湿地（北纬 22°32′06.6″，东经 88°26′13.8″）采集淡水双壳贝类蚬（Lamellidens marginalis），以分离粘质沙雷氏菌（S. marcescens） 。由于食用生的或未煮熟的双壳贝类可能因细菌污染带来风险，因此研究人员对分离出的细菌进行抗生素耐药模式研究。

研究人员使用好氧平板计数法分离出菌株 IFSMLMEK1。他们取 1 毫升双壳贝类全组织匀浆，接种到营养肉汤中，随后转移至营养琼脂平板，在 30°C 条件下培养 24 小时。挑选出具有纯红色色素沉着的菌落，通过革兰氏染色、生化试验以及使用引物 8F 和 1492R 进行 16S rRNA 基因测序来鉴定。将测序结果（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PP204294.1/）与 GenBank 中的序列对比，从而确认分子鉴定结果。按照临床和实验室标准协会（CLSI）指南（M100 - S28，2018），研究人员对菌株 IFSMLMEK1 进行抗菌药敏试验，选用不同类别的 β - 内酰胺类抗生素和非 β - 内酰胺类抗生素，包括氨基糖苷类、氟喹诺酮类和四环素类，结果发现该菌株对四环素类抗生素耐药。

研究人员刮取菌落，将其悬浮在 TE 缓冲液中，使用 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kit（47014）提取基因组 DNA。之后进行一系列操作，如利用安捷伦 FEMTO pulse 检测 DNA 大小分布，使用 NanoDrop 分光光度计和赛默飞世尔科技的 Qubit 3.0 荧光计检测 DNA 质量，通过 Megaruptor 3（比利时）进行 DNA 片段化，用安捷伦 FEMTO pulse 检测片段化 DNA 和 SMRTbell 文库大小分布，制备 SMRTbell 文库、纯化 SMRT 文库、筛选去除小于 5kb 的片段并制备结合复合物（太平洋生物科学公司），以便进行测序。研究人员在 PacBio Sequel II（美国太平洋生物科学公司，Nucleome Informatics Pvt Ltd）平台上进行从头全基因组测序，利用环形一致序列（CCS，v6.2.0）生成高保真（HiFi） reads，再通过 Flye v2.9.3 软件进行从头组装，得到一个大的重叠群（contig） 。使用原核基因组注释流程（PGAP）对基因组进行注释，通过 PGAP 进行平均核苷酸同一性（ANI）分析，将其与粘质沙雷氏菌亚种（Serratia marcescens subsp.marcescens）ATCC 13880 参考基因组对比，发现基因组相似性为 96.98%。GeneMarkS - 2 + 软件对缺乏隐马尔可夫模型（HMM）或蛋白质证据的基因组区域进行从头编码区域预测，并为 HMMs 提供证据的开放阅读框（ORFs）选择起始位点。使用 Prokka 软件进行基因识别和注释。通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）CheckM 分析（v1.2.3）进行质量分析，结果显示基因组完整性为 97.67%，污染率为 5.06%。利用综合抗生素耐药数据库中的耐药基因标识符工具识别抗菌耐药基因。此外，IFSMLMEK1 菌株携带嵌合四环素耐药基因，包括 tet (O/32/O) 和 tet (W/N/W)，这使其耐药谱更广。序列数据详细信息见表 1。研究人员使用 CLC Genomics Workbench 12 构建全基因组系统发育树，基于 k - mer 采用邻接法构建树，用马氏距离法测量进化距离。

这项研究由印度中央内陆渔业研究所（CIFRI）所长以及印度政府水资源部国家清洁恒河使命资助。