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来自南内华达学院的研究人员分离并鉴定了 Eddiemania 和 UBSmoodge 噬菌体,明确其基因组等特征,意义重大。
Eddiemania 和 UBSmoodge 噬菌体是从土壤中分离得到的,由南内华达学院通过科学教育联盟噬菌体猎手推进基因组学和进化科学(SEA-PHAGES)计划进行研究与特征分析。宿主细菌戈登氏菌(Gordonia rubripertincta)在生物修复方面具有潜在应用价值,能在实验室 30°C 条件下良好生长,可在 - 20°C 长期保存。
Eddiemania 噬菌体采自拉斯维加斯的一个公园,是直接分离获得的;UBSmoodge 噬菌体采自拉斯维加斯的一个社区,源于富集样本。噬菌体的分离、纯化和 DNA 提取按照 SEA-PHAGES《噬菌体发现手册》的实验方案进行。土壤样本在添加两性霉素 B 的 PYCa 培养基中,于 30°C、250 转 / 分钟的条件下振荡培养 1 小时,之后将上清液通过 0.22μm 的滤器过滤。对于直接分离法,过滤后的上清液直接用于噬菌斑检测;富集分离法则是将 10mL 上清液加入到 500μL 宿主细菌中,在 30°C、220 转 / 分钟的摇床上培养 3 天,在进行噬菌斑检测前,样本需再次通过 0.22μm 滤器过滤。经过三轮纯化和一轮扩增后,使用 Norgen 噬菌体 DNA 提取试剂盒,通过五次冻融循环(在干冰乙醇浴中冷冻 4 分钟,解冻 1 分钟)从高滴度裂解物中提取 DNA。噬菌体在匹兹堡噬菌体研究所利用 Illumina MiSeq 仪器进行测序,测序文库由提取的基因组 DNA 构建,采用新英格兰生物实验室 Ultra II Library 试剂盒 v.3,进行 150 碱基单端读取,按照制造商的说明操作。原始读数上传至 Newbler v.2.9(454 生命科学公司,罗氏),使用默认设置生成连续读数。读数通过 Consed v.2.9 软件,采用默认设置分析,生成单一重叠群,通过查找间隙和低一致性区域评估其准确性和完整性。利用 Galaxy 平台的 “Pileup Analysis Using Starts and Ends” 工作流程确定噬菌体基因组末端。浓缩纯化的裂解物滴在铜网上,用醋酸双氧铀(Uranyless acetate)染色后,送往北亚利桑那大学进行电子显微镜成像。
注释工作使用了多种程序,包括 DNA Master v.2.53.6、Starterator v.1.2、Phamerator、PhagesDB BLAST、美国国立生物技术信息中心(NCBI)BLAST(数据库:BLASTtn 标准核心核苷酸库和 BLASTp 标准非冗余库 )、PECAAN、GeneMark v.2.5p、Glimmer v.3.02、Aragorn v.1.1 和 v.1.2.38、HHPRED(数据库:蛋白质数据库(PDB)、NCBI 保守结构域数据库(NCBI-CD)、蛋白质家族数据库(PFam-A)和蛋白质结构分类扩展数据库(SCOPe) )、tRNAscan-SE v.2.0、DeepTMHMM v.1.0.24,均采用 SEA-PHAGES 生物信息学指南中的默认参数。
Eddiemania 噬菌体具有长尾噬菌体科(Siphovirus)的形态特征,共鉴定出 92 个基因,其中 24 个基因被赋予了假定功能。它拥有 3′粘性末端,基因组长度为 61427bp,预测编码 92 个假定基因。UBSmoodge 噬菌体呈现肌尾噬菌体科(Myovirus)的形态,有 130 个基因,36 个基因有假定功能。其基因组为环状排列,长度达 92786bp,预测编码 130 个假定基因。UBSmoodge 噬菌体在反向阅读框中有四个基因,在从反向阅读框转换到正向阅读框时存在 1178bp 的间隙,这四个反向基因和 1000 多 bp 的间隙是与其最相近噬菌体的特征。