探秘新型隐球菌中 CipC 蛋白：解锁真菌毒力调控新奥秘

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Proteome remodeling upon disruption of virulence-associated CipC from Cryptococcus neoformans

来自加拿大的研究人员探究新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）中 CipC 蛋白作用，发现其与真菌毒力及肽酶调控有关。

　　新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种人类真菌病原体，它能产生一系列毒力因子，这些因子可调节多糖荚膜和黑色素的生成、热耐受性，以及细胞外酶的释放。在本研究中，科研人员运用定量蛋白质组学技术，深入探究了已知毒力相关蛋白 CipC 在该真菌中的作用。

新型隐球菌广泛存在于环境中，主要感染免疫功能低下的个体。若宿主无法激活有效的免疫反应，该病原体就能借助多种毒力因子在宿主体内存活、增殖并扩散。这些毒力因子包括可保护真菌免受巨噬细胞吞噬的多糖荚膜、能中和活性氧的黑色素、使其在人体生理温度下生存的热耐受性，以及用于降解和入侵宿主组织的细胞外酶。此前，研究人员曾利用基于质谱的蛋白质组学技术，通过体外（巨噬细胞）和体内（小鼠）疾病模型，探索真菌在感染过程中毒力因子的产生情况。基于这些研究，此次研究人员对破坏 CipC（一种毒力相关的真菌蛋白）后新型隐球菌的蛋白质组反应展开了调查。

研究人员培养了新型隐球菌野生型 H99 菌株（ATCC 208821），并运用先前描述的技术（如基因枪转化、Southern 印迹）构建了 cipC 基因缺失菌株。在培养过程中，将野生型和 cipCΔ 菌株的单个菌落（三个生物学重复）分别转移到酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）肉汤中，在 30°C、200 转 / 分钟的条件下振荡培养过夜，随后以 1:100 的比例稀释到 5 毫升酵母氮源（YNB）肉汤中。在对数中期（约 8 小时）收集培养物，通过 3500 转 / 分钟离心 5 分钟获取细胞沉淀，并用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤两次。接着，按照之前的方法进行蛋白质提取，具体步骤为：将细胞重悬于含 2% 十二烷基硫酸钠的冷 100 mM Tris-HCl（pH 8.5）溶液中，用探针超声处理（30% 功率，超声 30 秒、暂停 30 秒，置于冰浴中），然后在 95°C 加入二硫苏糖醇（终浓度 10 mM）反应 10 分钟，在室温黑暗条件下加入碘乙酰胺（终浓度 5.5 mM）反应 20 分钟。之后，加入 100% 冰冷丙酮（-20°C）使蛋白质沉淀过夜，再用 80% 丙酮洗涤，将沉淀重悬于 8 M 尿素 / 40 mM HEPES 溶液中并进行定量。蛋白质在室温下用胰蛋白酶 / LysC（酶与蛋白质比例为 1:50）消化过夜，随后使用 STop And Go Extraction（STAGE） tips 对肽段进行脱盐处理。

肽段重悬于缓冲液 A（0.1% 三氟乙酸）中，利用纳流液相色谱（Neo VanQuish；赛默飞世尔科技）系统，以 250 nL / 分钟的流速，在填充有 2 μm C18 反相硅胶珠的 50 cm PepMap 喷雾柱（内径 75 μm）上，用缓冲液 B（80% 乙腈，0.5% 乙酸）进行 2 小时梯度分离。肽段的电喷雾电离与 Orbitrap Exploris 240 混合型四极杆 - 轨道阱质谱仪（赛默飞世尔科技）联用，质谱仪在数据依赖采集模式下运行，在 120,000 分辨率下采集质荷比（m/z）400 至 2,000 的全扫描数据。原始质谱数据文件使用 MaxQuant（2.4.10.0 版本）进行处理，该软件由 Andromeda 驱动，与来自 UniProt 的新型隐球菌格特变种血清型 A（菌株 H99/ATCC 208821）FASTA 序列（7,429 条序列；2024 年 10 月 11 日）进行比对。MaxQuant 的参数除了设定每个蛋白质至少包含两个肽段、通过 1 比率进行无标记定量以及启用运行间匹配外，其余均为默认值。数据使用 Perseus（1.6.2.2 版本）进行分析，对蛋白质进行过滤（去除污染物、反向肽段、通过位点鉴定的肽段，要求至少在一组中的 3 个重复样本中有 2 个有效数据）、log₂转换、归一化（从每个样本中减去中位数）和插补（采用宽度为 0.3、向下偏移 1.8 的正态分布）。统计检验采用 Student's t检验，P值 < 0.05，Benjamini-Hochberg 错误发现率校正因子为 0.05，S₀=1。

在新型隐球菌的总蛋白质组中，研究人员鉴定出 3,347 种蛋白质，野生型菌株的重复样本重现性为 87.9%，cipCΔ 菌株为 86.8%。通过主成分分析发现，不同菌株（第一主成分，占 44.4%）和重复样本（第二主成分，占 18.8%）之间存在明显差异。同时，研究人员观察到 66 种蛋白质的丰度发生了显著变化，其中 41 种蛋白质在野生型菌株中显著增加（包括作为阳性对照的 CipC），25 种蛋白质在 cipCΔ 菌株中显著增加，这些蛋白质包括一种推测在真菌毒力中起作用的肽酶以及转录调节因子。总体而言，这项研究为深入了解 CipC 在新型隐球菌中的作用提供了新的生物学见解，并揭示了真菌毒力与肽酶调控之间的新联系。

研究人员感谢圭尔夫大学高级分析中心质谱设施的经理 Dyanne Brewer 博士在质谱仪上对样本进行测量，感谢 Jason A. McAlister 博士提供生物信息学支持，感谢 Mariana Sa 博士提供技术培训。J.G.-M. 获得了加拿大卫生研究院（项目资助）的资金支持，B.B. 得到了加拿大自然科学与工程研究理事会博士研究生奖学金的支持。