墨西哥牛源水泡性口炎印第安纳病毒近乎全长序列解析及其意义

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Near-full-length vesicular stomatitis Indiana virus genome sequences representative of endemic strains circulating in Mexico

为探究墨西哥流行病毒与美国疫情关联，研究人员测定 VSIV 序列，为后续研究提供支撑。

　　水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）水泡病毒属（Vesiculovirus），是一种负链单股 RNA 病毒。已鉴定出两种主要的 VSV 血清型：新泽西型（VSNJV）和印第安纳型（VSIV）。这两种血清型在墨西哥南部各州流行，可能导致美国出现动物疫情。2019 - 2020 年美国发生的与 VSIV 毒株相关的重大动物疫情，是该国记录的最大规模疫情之一，凸显了 VSIV 对动物健康的重要性。然而，人们对地方流行毒株演变为动物疫情毒株的遗传决定因素知之甚少。

本文报道的 VSIV 序列 IN0817CPB 和 IN1017CPB，分别于 2017 年 8 月和 10 月从墨西哥恰帕斯州自然感染牛的水泡性病变中直接获取。

研究人员利用 MagMax - 96 病毒 RNA 分离试剂盒和 KingFisher 自动提取系统（Applied Biosystems）提取病毒 RNA。样本最初通过抗原 ELISA 进行鉴定，随后使用多重实时逆转录聚合酶链反应（rt - PCR）确认为 VSIV 阳性。接着，通过下一代测序获取两个样本近乎全长的序列。首先，用 ezDNase（ThermoFisher）处理 RNA 提取物，再用 RNeasy MinElute 试剂盒（Qiagen）进行纯化。使用 VSV 特异性引物（VSV_junction_S_IND_1_REV：5′ - TTATCCATGATATCTGTTAGTTT - 3′，VSV_junction_S_IND_2_REV：5′ - CTGTCCATGATCTCTGTTAGTTT - 3′）和 SuperScript IV（ThermoFisher）以及非核糖体六核苷酸合成互补 DNA（cDNA）。然后，使用 NEBNext Ultra II 第二链合成模块（NEB）进行第二链合成。在文库制备前，用 1.8×AMPure XP 磁珠（Beckman Coulter）纯化产物。利用 Nextera XT DNA 文库制备试剂盒和 Nextera XT 索引试剂盒 v2（条形码）（Illumina）构建文库，索引过程进行 16 个 PCR 循环。将文库与其他文库等摩尔混合，在 Illumina MiSeq 平台的 V3 300 循环流动池测序前，分别用 Qubit 3.0 荧光计和 dsDNA HS 试剂盒以及 BioAnalyser 2100 评估最终混合文库的浓度和片段大小分布。

之后，使用 BBDuk（v38.96）去除 Illumina PhiX 测序控制 V3 reads，再用 fastp 进行接头去除和质量过滤。从 IN0817CPB 和 IN1017CPB 分别获得 80802 和 155383 条 reads，平均读长 300bp。利用 Unicycler（v0.4.8）、Shovill（v1.1.0）和 MEGAHIT（v1.2.9）对过滤后的 reads 进行从头组装。通过 NCBI BLAST 鉴定，VSIV 98COE 毒株 [GenBank 登录号：（AF473864.1）] 是所有组装中匹配度最高的序列。使用 Geneious Prime（v2023.0.1）将 fastp 过滤后的 reads 与 98COE 进行比对，获得一致性序列。用 MAFFT（v7.490）将一致性序列与先前组装的序列进行比对，识别潜在错误。最后，在 Geneious Prime（v2023.0.1）中使用 Find ORFs 工具确定每个基因的完整编码序列。除另有说明外，均使用默认参数。

最终得到的 IN0817CPB 和 IN1017CPB 的一致性序列长度分别为 11059bp 和 11061bp，GC 含量均为 42.3%。它们与参考序列（98COE）的核苷酸同一性分别为 98.73%（IN0817CPB）和 98.84%（IN1017CPB），两者之间的核苷酸同一性为 99.60%。系统发育分析显示，IN0817CPB 和 IN1017CPB 可能是 2019 - 2020 年美国 VSIV 疫情毒株的潜在地方流行祖先。本文报道的序列将为未来研究确定地方流行和动物疫情 VSV 毒株之间的假定遗传决定因素提供支持。