敲除 cbu0533基因的贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）Nine Mile II 突变株基因组测序研究

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Whole genome sequence of Coxiella burnetii Nine Mile II, clone 4, ?cbu0533 mutant strain, an alternative for safer laboratory use

为解决贝氏柯克斯体 NMII 菌株 LPS 延长的安全隐患，研究人员对敲除 cbu0533基因的菌株测序，确认基因敲除。

　　贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是引发人类 Q 热和家畜 Coxiellosis 病的病原菌。脂多糖（LPS）是贝氏柯克斯体致病力的关键介质，且在体外传代时会发生相变异。相变异的特征是 LPS 截断和毒力丧失，贝氏柯克斯体 NMII 菌株的减毒就是例证，因此 NMII 菌株不受美国疾病控制与预防中心（CDC）、监管科学与合规部、联邦选择病原体计划法规的限制，可在生物安全 2 级实验室操作。近期，有研究发现 cbu₀₅₃₃基因突变回复会介导 NMII 菌株的 LPS 延长。为解决潜在的安全问题，研究人员构建了缺失 cbu₀₅₃₃基因的 NMII 菌株（NMI ?cbu₀₅₃₃），以防止 LPS 延长。

研究人员将贝氏柯克斯体 NMII ?cbu₀₅₃₃在酸化柠檬酸盐半胱氨酸培养基 - 2 中培养 7 天，16000×g 离心 15 分钟，然后使用 Qiagen HMW MagAttract 试剂盒提取 DNA。取 1μg DNA 样本作为 Illumina TruSeq DNA PCR-free 试剂盒的输入材料。将 55μL 的每个样本加入到 Covaris microTUBE-50 AFA Fiber 螺旋盖管中，在 Covaris M220 聚焦超声破碎仪中按照插入片段大小为 350bp 的标准条件（占空比 20%，峰值功率 50 瓦，每次脉冲 200 个循环，处理 65 秒）进行片段化处理。利用样本纯化磁珠进行样本大小筛选，按照 Illumina TruSeq DNA PCR-free 试剂盒和制造商推荐的方案构建文库（Illumina 文件编号：1000000039279 v00）。使用安捷伦生物分析仪对文库进行分析，并用罗氏 Kapa 文库 qPCR 试剂盒进行定量。将文库稀释至 4nM，变性后进一步稀释至 9pM 储存液。在 MiSeq 测序仪上使用 Nano V2 流动池和 300 循环化学试剂进行 2×150 循环的双端测序。测序完成后，利用 genome-seek 工作流程（https://github.com/OpenOmics/genome-seek）处理原始 fastq 文件，以验证 cbu₀₅₃₃基因的缺失情况。在该工作流程中，使用 fastp 0.23.2 版本修剪序列读数，然后使用 bwa-mem2 将其比对到合并的贝氏柯克斯体 RSA 439 参考基因组（NZ_CP020616.1）和 QpH1 质粒（NZ_CP020617.1）上。使用 samblaster 0.1.26 版本标记 PCR 重复序列，使用 GATK 3.8 版本对去重后的 BAM 文件进行插入缺失重比对。最终得到的 BAM 文件作为 DeepVariant 1.6.0 版本的输入文件。除特殊说明外，均使用软件默认参数。

这些数据证实了 cbu₀₅₃₃基因已被完全敲除。NMII 和 NMII ?cbu₀₅₃₃菌株之间观察到的遗传变异极少，包括染色体上的三个单核苷酸多态性（SNPs）和一个插入。原始读数数量为 2356376，平均基因组覆盖率为 174.36，平均质粒覆盖率为 184.28，SRA 登录号为（染色体）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR28260912、（质粒）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR28394675 ，GC 含量为 42.5%。