海洋蓝细菌Capilliphycus salinus共生细菌基因组测序揭示蓝细菌圈奥秘

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Metagenome-assembled bacterial genomes from long accurate reads associated with Capilliphycus salinus ALCB114379

来自巴西的研究人员对海洋蓝细菌Capilliphycus salinusALCB114379 相关细菌进行基因组测序，为研究蓝细菌圈提供新视角。

　　研究报道了与海洋蓝细菌Capilliphycus salinusALCB114379（属于变形菌门（Pseudomonadota））相关的 5 种细菌的完整基因组序列。这种遗传多样性为深入了解蓝细菌圈（cyanosphere）提供了线索，有助于揭示这些微生物与它们的蓝细菌宿主之间潜在的关系。

蓝细菌Capilliphycus salinusALCB114379 分离自巴西萨尔瓦多的滨海带普拉亚达佩德拉杜萨尔（12°57′06″S，38°20′42″W）。该区域位于高潮线和陆地环境之间，是一个动态的生态交错带，因其过渡性质而具有显著的环境波动。像C. salinus这样的蓝细菌已经进化出多种策略来在这种不利条件下生存，包括营造有利于各种微生物共生的环境。这种共生相互作用发生在 “蓝细菌圈” 中，这是蓝细菌细胞周围的一个特殊微环境，复杂的相互作用促进了互利共生关系。近期研究强调，蓝细菌圈是微生物交换的关键生态位，对波动环境中的营养循环和生态稳定起着重要作用。

本研究旨在对与蓝细菌C. salinusALCB114379 紧密相连的微生物进行特征分析。分离出的蓝细菌在农业核能中心的蓝细菌培养保藏中心保存，在 Z8 培养基中培养，光照 / 黑暗周期为 14:10 小时，荧光光照强度为（45 ± 5）μmol 光子?μm^-2·s^-1，温度为（22 ± 1）°C 。细胞在含有 50 mL 培养基的 125 mL 烧瓶中培养 20 天。培养结束后，通过离心收获并浓缩生物量。然后对细胞进行连续洗涤，以减少培养基中的细菌污染物以及附着在丝状结构上的细菌。使用 All - Prep DNA/RNA Mini 试剂盒（德国希尔德的 Qiagen 公司）按照制造商的说明从洗涤后的蓝细菌细胞中提取总基因组 DNA（gDNA）。通过 1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳评估提取的 gDNA 的完整性，并使用 Qubit 2.0 荧光计（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的 Life Technologies 公司）进行定量。在冻干过程中，添加终体积为 25%（vol/vol）的 DNA stable Plus（美国加利福尼亚州圣地亚哥的 Biomatrica 公司）以保持 gDNA 的完整性。冻干后的 gDNA 被送往联合基因组研究所（JGI 项目 ID：1292448）进行全基因组测序。在 JGI，使用 SMRTbell Express Template Prep 2.0 试剂盒方案制备 PacBio SMRTbell 文库，用于环形一致序列测序。使用 BluePippin 系统对基因组 DNA 进行 6 - 10 kb 范围的大小选择，随后在 PacBio HiFi 平台上进行测序。在 PacBio Sequel II 平台上使用 2.0 版本的化学试剂、8M v1 SMRT 细胞和 1 × 1,800 电影时间进行测序。对测序数据应用标准的 PacBio 处理步骤，包括错误校正和接头修剪。此外，测序后数据分析包括使用 BBMap v38.90 的 icecreamfinder.sh 管道对读数进行质量过滤，采用默认参数。

测序共产生 326,539 条读数，其中 322,185 条读数（98.67%）通过 Kaiju v1.2.9 使用 RefSeq 数据库进行分类学分类，以识别与蓝细菌C. salinusALCB114379 相关的潜在细菌污染。结果发现，25% 的读数属于蓝细菌门，大部分（69%）读数被鉴定为属于变形菌门，3% 属于浮霉菌门（Planctomycetota），2% 属于拟杆菌门（Bacteroidota）。其余 1% 分布在其他细菌门中，且比例均大于 0.1%。测序数据使用 Flye v2.9 进行从头组装（de novo assembly），使用 Bandage v2022.09 验证组装的环形性。分别使用 QUAST v4.4 和 CheckM v1.0.18 评估组装基因组的质量和完整性。使用 Bowtie2 v2.5.3 和 QualiMap v2.2.2 计算基因组的相对丰度。使用 GTDB - tk Classify v2.3.2 对分类学分类进行优化。使用 Prokka v1.14.6 进行基因注释。所有软件均采用默认设置。关于基因组重建的详细统计数据以及 5 种细菌的相关信息总结如下。

这项研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP，#2016/14227 - 5）和国家科学技术发展委员会（CNPq，#433166/2018 - 5）的资助。G.S.P. 通过巴西联邦支持与评估研究生教育机构（CAPES，财务代码 001）的硕士奖学金获得资金支持，T.A.P. 也获得了圣保罗大学 PRPI 的博士后奖学金（22.1.08498.01.0）。M.F.F. 获得了 CNPq 的研究奖学金（#309476/2022 - 4）。所有作者均完全符合 MRA 作者标准。G.S.P.、T.A.P. 和 M.F.F. 在组织和协调分析方面发挥了重要作用，M.F.F. 担任首席研究员，G.S.P. 领导数据分析工作。此外，所有作者都为最终手稿的撰写做出了重要贡献。