鸡肠球菌 IFEGHNEK1 全基因组测序揭示其耐药特征与进化关系

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Genome assembly of multidrug-resistant Enterococcus gallinarum IFEGHNEK1 isolated from bighead carp, Hypophthalmichthys nobilis

印度研究人员对鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）IFEGHNEK1 进行全基因组测序，发现大量耐药基因并明确其进化关系。

　　鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）IFEGHNEK1 是 2023 年从鳙鱼中分离出的一种属于肠球菌科的多重耐药菌。本研究报告了鸡肠球菌（登录号：CP169314）的完整基因组序列，其基因组大小为 3.15 Mb。

鸡肠球菌（肠球菌科）是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、兼性厌氧、不形成芽孢的球菌，能够在 6.5% 氯化钠肉汤中，于 10℃至 45°C 的较宽温度范围内生长。鸡肠球菌 IFEGHNEK1 分离自印度西孟加拉邦加尔各答东部湿地萨达尔?贝里养殖的鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）。有症状的鱼的组织样本（肠道、肝脏、肾脏和皮肤）经无菌匀浆后，转移到含有无菌胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的锥形瓶中。之后，根据形态、大小和颜色的独特性，从胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取单个菌落，并在 28°C 的 TSB 中培养过夜。在进行基因组测序前，通过生化分析和桑格测序法对 16S rRNA 基因进行测序，确认了该菌株属于肠球菌科。

细菌在有氧条件下，于 28°C 的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上培养 24 小时。刮取菌落，悬浮在 TE 缓冲液中，通过离心收集沉淀。使用 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒（货号：47014）从沉淀中提取基因组 DNA。随后进行一系列操作，包括 DNA 大小分布检测（美国安捷伦 FEMTO Pulse）、DNA 质量检测（美国赛默飞世尔 NanoDrop 分光光度计和 Qubit 3.0 荧光计）、DNA 片段化（比利时 Megaruptor 3）、片段化 DNA（8 - 10 kb）和 SMRTbell 文库大小分布检测（美国安捷伦 FEMTO Pulse）、SMRTbell 文库制备（Template Prepkit 3.0）、SMRT 文库纯化、文库大小筛选去除小于 5 kb 的片段，以及结合复合物的制备（美国太平洋生物科学公司），为测序做准备。利用 PacBio Sequel II 进行全基因组从头测序。使用 CCS（v6.2.0）将生成的原始子读数转换为高保真（HiFi）读数，HiFi 读数具有单分子 99.9% 的碱基分辨率。使用 Flyev2.9.3（一种具有 PacBio - HiFi 和质粒参数的从头组装器）进行基因组组装和评估。然后，使用 “QUAST” 和 “BUSCO” 工具，以 bacteria_odb10 为谱系对基因组完整性进行评估。组装后的基因组完整、呈环状且为单一重叠群。使用 ntCard 工具进行基因组概况分析。之后，采用美国国立生物技术信息中心（NCBI）的原核基因组注释流程（v6.8）进行注释，该流程结合了基于比对的方法以及直接从序列中预测蛋白质编码基因、RNA 基因和其他功能元件的方法。耐药基因标识符工具使用综合抗生素耐药数据库中的参考数据。利用 CLC 基因组学工作台 12 构建全基因组系统发育树，基于 k - mer 的树通过邻接法构建，使用马氏距离测量进化距离。

鸡肠球菌 IFEGHNEK1 的基因组组装特征如下：本研究组装的基因组完整性为 92.44%，污染率为 0.59%。它由一条长度为 3150305 bp 的闭合环状染色体组成，G + C 含量为 41%，包含 2889 个蛋白质编码序列、15 个 rRNA、61 个 tRNA、1 个 tmRNA 和 2443 个抗菌耐药（AMR）基因。研究人员鉴定出 3 个完美型和 2 个严格型 AMR 基因。该菌株与其他菌株密切相关，与来自南非、中国、日本、美国、加拿大和比利时的人类、小鼠、大鼠、食物、医院废弃物和鸡的分离株形成一个进化枝。

作者感谢印度农业研究委员会 - 中央内陆渔业研究所（ICAR - CIFRI）主任对实验和分析的支持。本研究得到了 “水生环境卫生评估与鱼类健康管理新配方开发（FREM/23 - 26/20）” 项目以及 “恒河流域渔业保护与种群增殖项目（Ad - 35012/1/2023 - NMCG - NMCG）”（由印度国家清洁恒河使命（NMCG）、水资源部资助）的支持。