内生枯草芽孢杆菌 A1 全基因组测序揭示其生防潜力与真菌互作机制

《Microbiology Resource Announcements 0.7》：Complete genome sequence of Bacillus subtilis A1, a Malus micromalus endophytic strain inducing pigment production of phylogenetically diverse panel fungi

来自安徽的研究人员对枯草芽孢杆菌 A1 展开研究，测定其基因组，发现其有生防潜力及诱导真菌产色素能力。

　　从楸子（Malus micromalus）叶片中分离出的内生细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）A1，对几种致病真菌具有拮抗能力，同时能诱导这些系统发育不同的真菌产生色素。研究人员对 A1 的完整基因组进行了测序和注释，其长度为 4,088,362 bp，GC 含量为 46.32%。

为筛选内生细菌，研究人员在中国安徽淮南采集了健康的楸子叶片（北纬 32°36′42.1″，东经 116°57′54.0″）。这些叶片分别用 75% 乙醇和含有效氯 2% 的次氯酸钠溶液进行表面消毒 3 分钟和 5 分钟。然后，将叶片置于研钵中研磨成碎块，加入 2 mL ddH?O 均质化，取 100 μL 悬浮液接种在 LB 琼脂平板上进行细菌分离。由于菌株 A1 具有很强的拮抗作用，且通过对峙培养能诱导几种真菌病原体产生局部色素积累，因此获得了该菌株，并通过分类学分析进一步鉴定其为枯草芽孢杆菌（未发表数据）。为全面了解菌株 A1 的生物防治潜力，以及在与 A1 相互作用过程中，许多系统发育不同的真菌次生代谢产物产生变化的潜在机制，研究人员测定了其完整基因组序列。

将菌株 A1 的单个菌落接种到 10 mL LB 肉汤中，在 28°C、200 rpm 振荡条件下培养 24 小时。使用 HiPure 细菌 DNA 试剂盒（中国美基）从细菌培养物中提取基因组 DNA，并使用 Qubit（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和 Nanodrop（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）评估其质量。合格的 DNA 通过 PacBio Sequel 和 Illumina NovaSeq 6000 进行全基因组测序。PacBio 测序在 Pacific Biosciences Sequel（美国加利福尼亚州门洛帕克）和 Oxford Nanopore PromethION（英国牛津纳米孔技术公司）平台上进行，分别产生了 110,195 条子读取，平均读取长度为 13,278.8 bp（N50 为 14,509 bp），并分别使用 FALCON 的二倍体感知长读取组装器 FALCON-Unzip（版本 0.3.0）和 Flye（版本 2.8.1-b1676）进行从头组装。另外，使用 NEBNext Ultra DNA 文库制备试剂盒（美国 NEB 公司）制备短读取文库，并使用 Illumina NovaSeq 6000 平台进行 150 bp 双端测序。使用 AMPure 磁珠进行大小选择，去除小于 1,000 bp 的片段，共产生 10,291,714 条读取和 154.3 Mbp 的测序数据（Q30 (%) = 92.52）。利用 Illumina 测序数据对 PacBio 测序的基因组序列进行校正，以提高其组装质量，然后通过 Pilon（版本 1.23）确定最终的基因组序列。除非另有说明，所有工具均使用默认参数。使用 NCBI 原核基因组注释流程预测开放阅读框（ORFs）。使用 rRNAmmer（版本 1.2）预测非编码 RNA（如 rRNA），而 tRNA 和 sRNA 分别通过 tRNAscan（版本 1.3.1）和 cmscan（版本 1.1.2）进行鉴定。使用 antiSMASH（版本 4.1.0）预测次生代谢产物的基因簇。

A1 的完整基因组由一个 4,088,362 bp 的环状染色体组成，G + C 含量为 46.32%，有 3,825 个编码序列。该基因组的其他特征总结如下。预测到 13 个与次生代谢产物产生相关的基因簇，包括 1 个非核糖体肽（NRPS）、2 个萜烯、1 个 Ⅲ 型聚酮合酶（T3pks）、2 个反式 - AT 聚酮合酶（Transatpks）、2 个反式 - AT 聚酮合酶 - 非核糖体肽合成酶（Transatpks-Nrps）、1 个细菌素 - 非核糖体肽合成酶（Bacteriocin-nrps）、1 个其他聚酮合酶（otherks）、1 个膦酸盐和 1 个其他类型。

本研究由安徽省自然科学基金（2108085QC118）和安徽省高等学校科研项目（2023AH051534，2023AH051538）资助。ZS 负责数据整理、调查、验证、撰写初稿和获取资金；QY 负责调查；HR 负责调查和获取资金；QW 负责概念构思、监督和撰写评审与编辑。