KPC酶变异对碳青霉烯类抗生素耐药性的影响及机制研究

《mSystems 5.0》：Diverse evolutionary trajectories of Klebsiella pneumoniae carbapenemase: unraveling the impact of amino acid substitutions on β-lactam susceptibility and the role of avibactam in driving resistance

本研究深入探讨了KPC酶变异对碳青霉烯类抗生素耐药性的影响，揭示了其进化机制，为应对耐药性挑战提供了重要依据（KPCs）。

　　

研究背景

Klebsiella pneumoniae 碳青霉烯酶（KPCs）是全球最常见的碳青霉烯酶，目前已进化出超过245种不同变异体，其中超过三分之一的变异体对头孢他啶-阿维巴坦（ceftazidime-avibactam，CAZ-AVI）表现出耐药性，但其背后的进化机制尚不清楚。本研究旨在通过克隆和分析多种KPC变异体，深入探讨其对β-内酰胺类抗生素耐药性的影响及其催化机制。

研究方法

研究人员克隆了33种临床描述的KPC变异体（从KPC-2到KPC-36）以及8种人工创建的变异体，并将其插入到一个共同的质粒载体中，评估它们对β-内酰胺类抗生素的耐药性影响。通过抗菌药物敏感性测试、酶动力学分析和分子建模等方法，研究了KPC-4、KPC-14、KPC-15、KPC-16、KPC-21、KPC-25、KPC-28、KPC-31以及祖先KPC-2和KPC-3酶的β-内酰胺水解催化机制。

研究结果

• KPC变异体的系统发育分析：构建了从blaKPC-2到blaKPC-36的最大似然（ML）系统发育树，发现KPC-2和KPC-3的多样化主要涉及单个非同义突变。KPC-3与KPC-2的主要区别在于C814T核苷酸的非同义突变，导致H274Y突变。超过91%的KPC变异体是在2015年CAZ-AVI上市后发现的，表明其近期加速多样化。
• 定点突变和KPC变异体在同源菌株中的耐药性分析：构建了表达blaKPC变异体2-36的同源大肠杆菌DH10B菌株。结果显示，KPC-2簇变异体对多种抗生素的MIC值较KPC-2参考菌株低，而KPC-3簇变异体则表现出不同的模式。特别是KPC-14、KPC-28、KPC-31等变异体对CAZ和CAZ-AVI的耐药性显著增加。
• KPC变异体的表达、纯化及稳态动力学特性：对10种KPC蛋白进行了表达和纯化，并比较了它们与KPC-2和KPC-3的酶活性。KPC-3的H274Y突变显著降低了对CAZ和头孢氨苄（cefazolin）的Km值，同时增加了对CAZ、头孢氨苄和亚胺培南（imipenem）的kcat/Km比值。KPC-14的242-243 GT缺失显著增加了对CAZ和头孢吡肟（cefepime）的kcat/Km比值，但降低了对碳青霉烯类的水解能力。
• 分子建模和等温滴定量热法分析：通过将KPC-2与AVI的晶体结构叠加到能量最小化的模型上，生成了KPC-3、KPC-14、KPC-28和KPC-31与AVI结合的模型。结果显示，242-243 GT缺失有助于KPC-14和KPC-28与AVI之间的氢键形成，导致AVI的解离常数（K_D）值增加，从而增加了MIC值。等温滴定量热法（ITC）分析表明，KPC-14、KPC-28和KPC-31与AVI的结合能力较KPC-2或KPC-3弱。

研究结论

本研究揭示了KPC酶变异对碳青霉烯类抗生素耐药性的影响及其进化机制。CAZ在KPC进化中起到了关键作用，通过选择能够高效水解CAZ的KPC变异体，推动了KPC的多样化。同时，AVI作为β-内酰胺酶抑制剂，也可能成为KPC进化的驱动力之一。这些发现为开发有效策略以应对碳青霉烯类耐药性Klebsiella pneumoniae（CRKP）感染提供了重要信息，有助于保护抗生素的有效性。