巴基斯坦野生鸟类大肠杆菌中发现多种耐药基因共现，敲响抗菌耐药警钟

《mSystems 5.0》：Emergence of plasmid-mediated fosfomycin resistance among Escherichia coli harboring fosA4, tet(X4), and mcr-1 genes in wild birds

本文首次发现巴基斯坦野生鸟类大肠杆菌中同时存在 fosA4、mcr-1 和 tet (X4) 基因，揭示耐药基因传播风险。

　　

抗菌耐药现状与研究背景

抗菌耐药性（Antimicrobial Resistance，AMR）已成为全球公共卫生领域的重大难题，严重阻碍了细菌感染的预防和治疗。随着抗菌药物在食品动物养殖中用于治疗、预防疾病以及促进生长，加上人类医学中不合理的处方用药，多药耐药（Multidrug-resistant，MDR）细菌在全球范围内日益增多。野生鸟类因与人类和动物密切接触，且活动范围广，被视为 AMR 监测的重要指示生物，其携带的 AMR 细菌及耐药基因（Antimicrobial Resistance Genes，ARGs）可能传播给人类和其他动物，带来潜在健康风险。

磷霉素（Fosfomycin）作为治疗多重耐药菌感染的最后一道防线，在临床治疗中具有重要地位，尤其是对尿路感染（Urinary Tract Infections，UTIs）疗效显著，被世界卫生组织列为最高优先级的关键抗菌药物。然而，质粒介导的磷霉素耐药基因在革兰氏阴性菌中出现，给临床治疗带来巨大挑战。大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）对磷霉素的耐药机制主要有三种：一是转运蛋白基因 glpT 和 uhpT 突变，降低磷霉素在细胞内的积累；二是调控机制，即磷霉素靶基因 murA 过表达；三是获得质粒介导的乙二醛酶和金属酶，使谷胱甘肽与抗生素的环氧环结合，阻碍其活性，如 FosA1 - 10、FosC2 和 FosL1 - 2 等。其中，质粒介导的 fosA3 和 fosA4 基因在不同来源的大肠杆菌中均有报道，且被认为起源于格氏柠檬酸杆菌（Kluyverra georgiana）。

目前，关于野生鸟类大肠杆菌中磷霉素耐药情况的数据十分有限。本研究旨在探究巴基斯坦费萨拉巴德市城市野生鸟类中磷霉素耐药大肠杆菌的情况，为抗菌耐药监测提供重要依据。

材料与方法

1. 样本采集与菌株分离：在 2022 年 5 月，从巴基斯坦费萨拉巴德市不同公共公园中随机采集 100 份野生鸟类（包括鸢和家鸦）新鲜粪便样本。这些鸟类在公园觅食，与人类活动存在已知的相互作用。用无菌棉签采集单个新鲜粪便样本，将其与无核酸酶水或 PBS 缓冲液混合后，取 50 - 100 μL 接种到添加磷霉素的脑心浸液肉汤中，37°C 振荡培养 6 小时。随后，将样本接种到添加了 32 μg/mL 磷霉素、葡萄糖 6 - 磷酸的 UTI ChromoSelect 琼脂上，37°C 培养 18 小时，以分离磷霉素耐药的大肠杆菌菌株。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间技术（Bruker）确认细菌种类，并通过 PCR 检测磷霉素耐药菌株中 fosA3 和 fosA4 基因的存在。
2. 抗菌药敏试验：对所有 fosA 阳性菌株进行 14 种抗菌药物的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）测定，包括四环素（Tetracycline，TET）、氨苄西林（Ampicillin，AMP）、美罗培南（Meropenem，MEM）、替加环素（Tigecycline，TIG）等。按照临床和实验室标准协会指南计算结果，对于粘菌素（Colistin，CST）和替加环素耐药 MIC 的解释，则依据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）设定的临界值。以大肠杆菌 ATCC 25922 作为质量控制菌株。
3. 全基因组测序与生物信息学分析：使用 FastPure Bacterial DNA Isolation Mini Kit（Vazyme，中国）高效提取 11 株磷霉素耐药大肠杆菌的基因组 DNA。提取的 DNA 经离心、蛋白酶 K 裂解、RNase 处理后，通过 Colibri LB 915 分光光度计和凝胶电泳评估其浓度和质量。采用 Illumina HiSeq2500 平台（Illumina，美国）进行双端测序（2×150 bp），利用 SPAdes v3.13.1 软件生成草图基因组组装。通过在线工具确定多位点序列类型（Multi - Locus Sequence Typing，MLST），使用 ResFinder v4.1、PlasmidFinder v2.1 和 Isfinder v2.1 分别检测获得的 ARGs、质粒复制子类型和插入序列。用 Prokka v1.12 对草图组装的重叠群进行注释，基于基因组单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）距离，使用 Roary 和 FastTree 进行系统发育分析，利用 iTOL v5 在线软件可视化系统发育树，通过 snp - dists v0.7.0 创建基于核心基因组 SNP 的成对距离矩阵。根据系统发育分析结果，选取三株菌的基因组 DNA，使用 Oxford Nanopore Technologies MinION 平台进行长读长测序，通过 Unicycler v0.4.8 将短 Illumina 读长和长 Nanopore 读长整合进行从头组装，获得完整基因组，再利用快速注释子系统技术（RAST）进行注释。使用 BRIG v0.95 和 Easyfig v2.2.3 分别对本研究的磷霉素耐药菌株与 NCBI 数据库中的在线序列进行环形和线性比较，揭示遗传背景。

研究结果

1. fosA4 阳性大肠杆菌菌株的鉴定：通过 PCR 从野生鸟类粪便样本中鉴定出 11 株 fosA4 阳性大肠杆菌菌株，未检测到 fosA3 阳性菌株。值得注意的是，所有 fosA4 阳性菌株均同时携带替加环素耐药基因 tet (X4)，其中一株还额外携带粘菌素耐药基因 mcr - 1。
2. fosA4 阳性菌株的抗菌耐药谱：抗菌药敏试验结果显示，所有 fosA4 阳性菌株（100%）对替加环素（2 - 8 μg/mL）耐药，4 株对粘菌素耐药，MIC 值在 4 - 8 μg/mL 之间。所有菌株对美罗培南高度敏感，但对四环素、氨苄西林、卡那霉素、氟苯尼考、庆大霉素、链霉素、头孢曲松、多西环素、阿莫西林、恩诺沙星和利福平表现出中到高耐药性。
3. 系统发育分析与克隆关系：全基因组测序分析揭示了 11 株 fosA4 阳性菌株的系统发育谱系和克隆关系。系统发育树显示，携带 fosA4 的大肠杆菌分布在 6 种不同的 ST 类型中：ST206（n = 4）、ST746（n = 2）、ST69（n = 2）以及各 1 株的 ST48、ST1431 和 ST2099。同一 ST 类型内菌株的 SNP 距离表明，部分菌株之间存在密切关系，如 ST206 中的 PKF2、PKF3、PKF7 和 PKF9，SNP 距离在 0 - 4 之间；而不同 ST 类型菌株间的 SNP 距离则反映出一定的遗传多样性，这表明 fosA4 和 tet (X4) 基因在野生鸟类中的传播既有克隆传播，也有非克隆传播。
4. 获得性耐药基因的流行情况：11 株分离株中 ARGs 的流行情况差异较大，所有菌株均被认定为 MDR 病原体。除 fosA4 外，还检测到 28 种其他耐药基因，这些基因赋予细菌对氨基糖苷类、β - 内酰胺类、氯霉素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类、替加环素、多粘菌素类、林可酰胺类、磺胺类和甲氧苄啶等多种抗生素的耐药性。其中，PKF8 携带的耐药基因数量最多，达 19/28（67.85%）。最主要的 ARGs 包括 tet (A)、tet (X4)、aph (3") - Ib 和 aph (6) - Id，分别对四环素、替加环素和氨基糖苷类耐药，在所有菌株中均有出现（n = 11，100%）。此外，还发现了多种氨基糖苷类、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、甲氧苄啶类耐药基因，以及 β - 内酰胺类耐药基因的不同变体。在 11 株分离株中，共发现 22 种不同类型的复制子，每种菌株至少含有两种复制子序列类型，IncHI1B（pNDM - CIT）、ColE10 和 p0111 是最常见的质粒不相容群。
5. fosA4 和 mcr - 1 菌株的基因组特征：对 PKF4、PKF8 和 PKF11 三株菌进行长读长测序和基因组分析发现，fosA4 基因位于 MDR IncFII 质粒上，该质粒还携带 dfrA12、mph (A)、tet (X4)、floR 和 bla_{TEM - 215}等多个 ARGs。与 NCBI 数据库中报道的 5 个质粒相比，这三株菌的 fosA4 携带质粒具有高度遗传相似性，同一性在 99.97% - 100% 之间，覆盖度在 95% - 96% 之间。此外，IS26 插入序列位于 fosA4 基因上下游，ISCR2 位于 tet (X4) 上下游，这些插入序列可能促进基因在质粒内的移动。PKF8 除携带 fosA4 外，还在 IncHI2（~252 Kb）质粒上携带 mcr - 1 基因。Blastn 分析显示，pPKF8 - mcr - 1 与来自沙门氏菌的 pCSFA1096（CP033347）、大肠杆菌鸡源分离株 pPK8217（CP080121）和临床分离株 pPK5074（CP072803）具有高度遗传相似性，同一性分别为 99%（100% 覆盖）和 100%（100% 覆盖）。

讨论

本研究首次报道了在巴基斯坦野生鸟类大肠杆菌中 mcr - 1、tet (X4) 和 fosA4 基因的共存现象。研究中，磷霉素耐药的大肠杆菌菌株对多种测试抗生素耐药，包括替加环素和粘菌素，这与之前瑞士对环境样本中磷霉素耐药肠杆菌科细菌的研究结果一致，均呈现 MDR 模式。

此前研究报道了多种 fosA 变体在肠杆菌科中的存在情况，但在不同地区和样本来源中，fosA 变体的流行情况有所差异。在本研究中，磷霉素耐药主要归因于 fosA4，而以往研究多认为 fosA3 是大肠杆菌对磷霉素耐药的最常见变体。例如，中国的两项研究分别报道了 CTX - M 和碳青霉烯酶产生菌中 fosA3 基因的流行率为 27.4% 和 10.3%；西班牙研究发现 55 株大肠杆菌中有 3 株（5.5%）携带 fosA3、fosA4 和 fosA6 基因；葡萄牙研究中 19186 株大肠杆菌中 fosA4 的临床发生率仅为 0.02%。

本研究从野生鸟类中分离出 MDR 菌株，表明质粒携带的多种 ARGs 在环境中存在共现现象，也证实了从环境样本中分离磷霉素耐药大肠杆菌可作为临床 AMR 的重要监测指标。fosA4 和 tet (X4) 基因在大肠杆菌中的共存分布于 6 种不同 ST 类型，其中 ST48 和 ST69 最为重要，这些 ST 类型此前在废水处理厂、鸡、人类和野生鸟类的磷霉素耐药大肠杆菌中均有报道。本研究中 11%（11/100）的大肠杆菌同时携带 fosA4 和 tet (X4) 基因，且有 1 株还携带 mcr - 1 基因，这一结果与巴基斯坦鸡源大肠杆菌中 11%（4/36）的 tet (X4) 阳性菌株同时携带 tet (X4)、mcr - 1 和 fosA4 基因的报道相似，也与埃及鸡源大肠杆菌中 12.5%（4/50）存在四环素、粘菌素和磷霉素耐药现象一致，尽管埃及菌株携带的是 tet (X7) 而非 tet (X4)。

本研究中 fosA4 的较高发生率提示，质粒介导的磷霉素耐药基因的发生率可能存在区域差异。同时，与鸡源大肠杆菌相比，fosA4 在废水样本中的流行率更高。如土耳其的研究显示，污水处理厂和医院污水中大肠杆菌的 fosA4 阳性率分别为 62%（18/29）和 34.4%（10/29），而鸡肉样本中 fosA4 和 fosA3 基因的阳性率分别为 47.6%（10/21）和 33.3%（7/21）。fosA4 基因在人类、动物和环境中的广泛存在，表明其可能通过食物链和环境在 One Health 框架内传播，野生和候鸟可能是主要传播媒介。

本研究中，fosA4 基因位于 IncFII 结合性质粒上，与 tet (X4) 和 bla_{TEM - 215}共存，这与之前鸡源样本的报道相符，但与中国研究中鸡和鸭源大肠杆菌携带的 IncFII 质粒有所不同，中国研究中的质粒携带 fosA3、bla_{CTX - M}、bla_TEM和 rmtB 等 4 种耐药基因。此外，fosA4 基因所在区域上下游的 IS26 插入序列有助于其在质粒间或染色体上的移动，扩大了耐药基因的传播潜力。

综上所述，持续监测和基因组分析对于评估磷霉素耐药性对人类、动物和环境健康的影响至关重要，应在 One Health 框架下开展相关研究。

研究结论

本研究首次在南亚地区发现巴基斯坦野生鸟类粪便样本中的大肠杆菌同时携带 fosA4、mcr - 1 和 tet (X4) 基因。系统发育分析表明，大肠杆菌携带的 MDR 质粒能够在野生鸟类、食用动物和人类之间水平传播。全基因组测序分析显示，fosA4、tet (X4) 和 mcr - 1 的同源基因组在鸡源和人源分离株中普遍存在。这些发现表明，野生鸟类可能是 ARGs 的潜在储存库，能够在全球范围内促进 ARGs 的传播。因此，有必要持续监测野生鸟类中新兴 ARGs（如 fosA4 和 mcr - 1）的流行情况和传播动态，以应对日益严峻的抗菌耐药问题。

致谢

本研究得到了澳大利亚昆士兰大学的 Rafat Al - Jassim 副教授对论文的宝贵意见。同时，该研究得到了国家自然科学基金（no. 32161133005）、江苏省自然科学基金（no. BK20231524）和江苏省高等学校优势学科建设工程（PAPD）的资助。研究人员各自承担了不同的工作，A.M. 负责草案准备和数据分析；X.L. 进行测序和草案编辑；F.H. 负责样本采集和初步筛选；C.K. 参与审核和编辑；M.S.M. 和 S.G. 进行审核；R.L. 和 Z.W. 负责获取资金；R.L. 和 M.M. 负责研究的概念构思、设计和监督。