Tas2r105：炎症性肠病治疗新希望？

《mSystems 5.0》：Tas2r105 ameliorates gut inflammation, possibly through influencing the gut microbiota and metabolites

研究发现 Tas2r105 在炎症性肠病（IBD）中具免疫调节作用，或为治疗提供新靶点。

　　# Tas2r105 在炎症性肠病中的关键作用研究进展
炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一类免疫介导的胃肠道疾病，主要包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）。它以慢性、进行性肠道炎症为特征，严重影响全球患者的生活质量。在 20 世纪后期，IBD 曾被认为是西方特有的疾病，但进入 21 世纪，其在全球范围内的发病率和患病率都显著上升，亚洲地区的患病人数也在不断增加。尽管遗传易感性和环境因素，如饮食、肠道菌群组成等，在 IBD 的发生发展和肠道炎症复发中起着重要作用，但目前 IBD 的病因和调控机制仍不明确，对于现有治疗方案无响应的患者，急需新的、更有效的治疗方法。

研究背景

味觉受体及其同源物属于 G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs），最初在舌头上被发现，主要负责检测甜味、鲜味和苦味化合物，评估口腔中食物的成分。近年来研究发现，味觉信号转导通路也存在于舌外组织，不过这些舌外味觉受体的具体功能大多还不清楚。

Tas2r 是味觉 2 受体家族，除了负责苦味转导外，还参与调节内分泌、行为和免疫反应。该家族在啮齿动物中有约 35 个功能成员，在人类中有 25 个。越来越多证据表明，Tas2r 在全身广泛表达，介导多种非味觉功能。例如在气道中，Tas2r 激活可增加纤毛运动、抑制平滑肌收缩，并参与气道上皮细胞的先天免疫反应；在免疫细胞中也有 Tas2r 的身影，像 Tas2r138 在小鼠中性粒细胞中表达，能通过促进 AHL - 12 生成抵御铜绿假单胞菌感染；人类 Tas2r14 可通过产生一氧化氮增强巨噬细胞的吞噬作用。此外，Tas2r 在肠道中也有表达，能在肠内分泌 STC - 1 细胞中引发 Ca^{2 +}信号，帮助机体抵御病原体感染，维持肠道菌群平衡。

Tas2r105 是 Tas2r 家族的特定成员，在口外组织广泛表达，具有重要的非味觉功能。在肾脏中，它有助于维持肾小球和肾小管的结构；牙周的 Tas2r105 能与 gustducin 偶联，通过与口腔细菌产生的代谢物相互作用调节宿主先天免疫。研究还观察到，在结肠炎小鼠中 Tas2r105 表达显著增加，因此推测 Tas2r105 可能在 IBD 发病机制中发挥免疫调节作用，进而开展了后续实验研究。

材料和方法

实验动物

实验选用 C57BL/6 背景的小鼠，其中 12 只 6 - 7 个月大的雄性野生型（WT）小鼠购自 Slaccas 公司（上海，中国），10 只 6 - 7 个月大的雄性 Tas2r105 基因敲除（KO）小鼠由上海公共卫生临床中心提供。Tas2r105 KO 小鼠通过 Crispr/Cas9 技术构建，饲养在特定病原体 - free（SPF）动物单独通风笼中，环境温度维持在 23 ± 1℃，湿度 45% - 65%，采用 12 小时光照 / 黑暗循环，小鼠可自由获取食物和水。所有动物实验均获得上海公共卫生临床中心伦理委员会批准（2019 - A030 - 01），并严格按照国家和欧盟指南进行。

诱导结肠炎及疾病严重程度评估

实验小鼠先自由饮食一周，随后分为四组：WT - H₂O（n = 6）、WT - DSS（n = 6）、Tas2r105 KO - H₂O（n = 5）和 Tas2r105 KO - DSS（n = 5）。通过给小鼠饮用含 3.5% 葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium，DSS；MW 36,000 - 50,000，MP Biomedicals，美国）的水 7 天，诱导急性结肠炎模型，对照组小鼠同时给予无菌水。每天观察小鼠体重和粪便性状，按说明书进行粪便潜血试验，根据特定表格计算疾病活动指数（Disease activity index，DAI）。第 8 天，通过腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，收集外周血、肠道组织和粪便用于后续研究。

免疫荧光和免疫组化分析

对于免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）染色，取部分结肠组织在 4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）中固定过夜，然后石蜡包埋。将切片切成 3μm 厚，进行苏木精 - 伊红（Hematoxylin and eosin，H&E）染色，根据上皮损伤和炎症细胞浸润情况对结肠组织进行组织学评分。免疫荧光实验中，切片先与指定的一抗在 4℃孵育过夜，再与相应的二抗在室温孵育 1 小时。使用兔抗 occludin 单克隆抗体、兔抗 ZO - 1 单克隆抗体评估肠道屏障完整性；使用小鼠抗 CD4 单克隆抗体、抗 CD8 单克隆抗体、抗 F4/80 单克隆抗体和抗 Ly6G 单克隆抗体检测结肠中免疫细胞的浸润情况。最后用显微镜采集图像，计算每个隐窝中 occludin 阳性和 ZO - 1 阳性细胞数量，以及 CD4、CD8、F4/80 和 Ly6G 阳性细胞的百分比。

定量实时荧光定量聚合酶链反应（qRT - PCR）分析

取小鼠远端结肠小片段，用 Trizol 试剂溶解提取总 RNA，使用第一链 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA，利用 QuantStudioTM6 Flex 实时荧光定量 PCR 仪（ABI，美国）和 SYBR Premix Ex TaqTM II mix（Takara，日本）进行 qRT - PCR 实验。根据特定引物序列，采用 2^?ΔΔCT方法计算相对 mRNA 水平，并以管家基因甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase，GAPDH）进行标准化。

杯状细胞计数和糖原合成检测

将结肠组织在 4% PFA 中固定过夜，石蜡包埋后切成 3μm 厚切片。采用阿尔辛蓝染色法和过碘酸 - 希夫（Periodic acid–Schiff，PAS）染色法对杯状细胞进行染色。

肠道微生物群 16S rRNA 基因测序

提取 WT 对照组和 Tas2r105 KO 对照组小鼠粪便样本中的总 DNA，在琼脂糖凝胶上分析 DNA 浓度和纯度。在 PCR 系统上扩增 16S rRNA 基因的 V34 区域，按照试剂盒说明使用 NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit（Illumina，美国）构建测序文库。利用 Fastp（v0.22.0）和 FLASH（v1.2.11）软件处理数据获得 clean tags 数据，在 NovaSeq6000 系统（Illumina，美国）上进行测序。采用 UPARSE（v7.0.1001）算法分析序列，USEARCH（v7）对所有样本的有效标签进行聚类，将相似度≥97% 的序列归为同一操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）。通过 Chao1 和 Shannon 指数评估样本内物种复杂性（α 多样性），基于非加权 Unifrac 距离进行非度量多维缩放（Nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析和主坐标分析（Principal coordinate analysis，PCoA）评估样本间物种多样性差异（β 多样性），使用线性判别分析效应量（Linear discriminant analysis effect size，LEfSe）突出不同菌群组成的核心细菌表型，并进一步研究特定科和属的相对丰度。

肠道代谢组学分析

委托武汉迈维代谢生物科技有限公司采用液相色谱 - 质谱联用（Liquid chromatography–mass spectrometry，LC - MS）技术评估 WT 对照组和 Tas2r105 KO 对照组小鼠的肠道代谢差异。实验过程中制备质量控制样本（Quality control sample，QC）监测分析过程的重复性，通过总离子流图（Total ion flow graph，TIC 图）的重叠显示分析判断代谢物提取和检测的重复性。使用 Analyst 1.6.3 软件处理质谱数据，对代谢物数据进行 log2 转换后进行统计分析，通过搜索实验室自建数据库获得代谢物鉴定信息，结合倍数变化和投影变量重要性（Variable importance in projection，VIP）值筛选差异代谢物。采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least - squares discriminant analysis，OPLS - DA）进行多变量统计分析，以 VIP 得分≥1、P < 0.05、倍数变化≥2 或≤0.5 为标准筛选差异代谢物，利用火山图和热图展示组间代谢物差异，并通过 KEGG 数据库进行差异代谢物的通路富集分析。

统计分析

所有数据以均值 ± 标准差（Standard deviation，SD）表示。采用单因素方差分析（One - way analysis of variance，ANOVA）分析四组间的差异，若方差齐性（P > 0.05），采用最小显著差异法（Least significant difference，LSD）进行事后检验；若方差不齐（P < 0.05），则采用 Dunnett’s T3 检验。使用 t 检验分析 WT - DSS 和 KO - DSS 组中浸润免疫细胞的百分比，以及 WT 小鼠和 KO 小鼠、KO - H₂O 和 KO - DSS、WT - DSS 和 KO - DSS 之间 TNF - α/IFN - γ 基因表达差异。采用 Spearman 相关检验确定肠道微生物群和代谢组之间的相关性。使用 R 软件（v4.2.0）和 GraphPad Prism 8 绘制图表，P < 0.05 认为具有统计学意义。

研究结果

Tas2r105 基因敲除小鼠对 DSS 诱导的结肠炎高度敏感

研究发现，在 DSS 诱导的小鼠炎症结肠中，Tas2r105 基因表达增加。为探究 Tas2r105 通路是否参与结肠炎的免疫反应，在 DSS 诱导的急性结肠炎模型中对 Tas2r105 基因敲除小鼠进行实验。连续 7 天饮用 DSS 后，WT 和 KO 小鼠体重均显著下降，但两组间无明显差异。有趣的是，Tas2r105 KO 小鼠结肠长度有所增加，不过与 WT 小鼠相比差异无统计学意义。然而在结肠炎模型中，KO 小鼠结肠长度明显短于 WT 小鼠，这表明 Tas2r105 KO 小鼠的结肠炎更为严重。KO - DSS 小鼠的 DAI 评分在第 5 天急剧上升并超过 WT - DSS 组。进一步的组织病理学分析显示，DSS 处理后，KO 小鼠结肠损伤比 WT 小鼠更严重，隐窝丢失和免疫细胞浸润明显增多，组织学评分也更高。这些结果表明，Tas2r105 在保护小鼠免受 DSS 诱导的结肠损伤中起着关键作用。

Tas2r105 KO 小鼠在结肠炎模型中肠道屏障破坏和杯状细胞丢失加剧

肠道屏障破坏和肠道通透性增加被认为是 IBD 的危险因素。在肠道中，紧密连接（Tight junctions，TJs）对调节肠道屏障起核心作用，occludin 和 zonula occludens - 1（ZO - 1）是 TJs 的关键组成部分，其缺失或表达降低会导致屏障功能障碍。研究发现，KO - H₂O 小鼠与 WT - H₂O 小鼠相比，TJ 蛋白表达无显著差异，但在 DSS 处理的小鼠中，KO 小鼠的 occludin 和 ZO - 1 蛋白水平显著低于 WT 小鼠，且在 mRNA 水平也得到了证实。

肠道上皮形成的物理屏障由黏液层进一步保护，黏液由杯状细胞产生。通过 AB/PAS 染色发现，与 WT - DSS 小鼠相比，KO - DSS 小鼠杯状细胞数量减少，肠道黏液层明显变薄。这表明 Tas2r105 KO 小鼠的结肠更容易受到 DSS 诱导的损伤，说明 Tas2r105 可能在肠道炎症中起保护作用。

Tas2r105 KO 小鼠固有层中巨噬细胞增多，T 淋巴细胞减少

研究结果显示，Tas2r105 KO 小鼠对 DSS 诱导的损伤更敏感，提示 Tas2r105 可能是一种抗炎分子。通过免疫荧光实验评估肠道黏膜中免疫细胞的浸润情况，使用 F4/80 和 Ly6G 抗体分别区分巨噬细胞和中性粒细胞。在 DSS 处理组中，KO 小鼠的 CD4⁺ T 和 CD8⁺ T 淋巴细胞减少，而 F4/80⁺巨噬细胞在固有层黏膜中增多，中性粒细胞浸润无明显差异。

此外，KO - H₂O 小鼠肠道中 TNF - α 和 IFN - γ 的 mRNA 水平比 WT - H₂O 小鼠显著升高。值得注意的是，DSS 处理后，KO 小鼠的 TNF - α 表达升高，而 IFN - γ 水平下降；与 DSS 处理的 WT 小鼠相比，DSS 处理的 KO 小鼠 TNF - α 水平升高，IFN - γ 表达无变化。这些结果表明，Tas2r105 可能主要通过抑制 TNF - α 通路来保护肠道免受炎症侵害。

Tas2r105 KO 小鼠肠道菌群结构和功能发生改变

肠道菌群及其代谢物在 IBD 发病机制中起着关键作用，味觉受体的新功能之一是调节对微生物的免疫反应和代谢。由于味觉受体影响食物感知和饮食习惯，推测 Tas2r105 可能调节肠道菌群，进而影响 Tas2r105 KO 小鼠的结肠损伤。

通过 16S rRNA 基因测序发现，共鉴定出 2196 个 OTUs。在门水平上，两组小鼠中主要的细菌门为 Bacteroidota 和 Firmicutes，但 Tas2r105 KO 小鼠中 Proteobacteria 水平显著升高，Firmicutes 明显减少。在属水平上，KO 小鼠中 Fusicatenibacter 显著下调，Defluviicoccus 和 Phenylobacterium 增加。通过 Chao1 和 Shannon 指数评估微生物丰富度和多样性，发现两组间无显著差异，表明 Tas2r105 缺失对肠道菌群的 α 多样性影响较小。NMDS 分析显示，同一组的样本聚集在一起，组间 β 多样性无显著差异，但通过 LEfSe 分析发现，WT 组富含 Lachnospiraceae bacterium A2、Anaerotruncus 和 Staphylococcaceae 家族，而 KO 小鼠富含 Clostridium sp culture 1、Comamonadaceae 和 Oscillospiraceae。此外，ANOSIM 分析表明两组菌群结构存在显著差异。在物种水平上，KO 小鼠中 Bacteroides acidifaciens 和 Clostridium sp. culture 1 明显增加，Helicobacter typhlonius 显著减少。

Tas2r105 基因敲除改变粪便代谢物

采用 LC - MS 技术测定肠道代谢组学谱，通过 OPLS - DA 模型进一步分析两组间的差异代谢物。OPLS - DA 得分图显示两组样本明显分离。以 VIP≥1.0 且 P < 0.05 为标准筛选出 24 种差异代谢物，其中 6 种在 KO 小鼠中显著增加，18 种显著减少。KO 小鼠粪便中甘油磷脂（Glycerophospholipids，GPs）和核苷酸相关代谢物的相对含量显著降低，KO 小鼠富含六甘醇、甘胆酸、3 - 氨基酚和全反式视黄醛，而 WT 小鼠富含溶磷脂酰乙醇胺（Lysophosphatidylethanolamine，LPE）、乙酰胆碱、腺苷、5′ - 脱氧 - 5′ - 氟腺苷和游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）。

Tas2r105 KO 小鼠肠道菌群与代谢物之间的相关性

通过 Spearman 相关系数分析两组小鼠肠道菌群变化与代谢产物之间的潜在关系，发现未鉴定的 Muribaculaceae 与 LPE、FFA、2 - 氨基 - 3 - 膦酰丙酸、腺苷、5′ - 脱氧 - 5′ - 氟腺苷、3 - 羧丙基三甲基铵、N - 甲酰甘氨酸、阿糖腺苷和乙酰胆碱呈负相关；Bacteroides acidifaciens 与 LPE、FFA、3 - 羧丙基三甲基铵和 N - 甲酰甘氨酸呈负相关；Clostridium 与腺苷、5′ - 脱氧 - 5′ - 氟腺苷、乙酰胆碱呈负相关，与全反式视黄醛呈正相关；Corynebacterium_urealyticum 与 LPE、FFA 和 3 - 羧丙基三甲基铵呈正相关。

讨论

以往认为 Tas2r 仅存在于舌头上，负责将苦味信息传递给大脑，但近年来研究发现其与多种疾病相关。在本研究中，观察到 DSS 诱导的结肠炎小鼠炎症结肠中 Tas2r105 表达增加，且 Tas2r105 基因缺失会加重结肠炎，促进促炎细胞因子释放，加剧上皮屏障损伤。进一步的微生物学和代谢组学研究表明，Tas2r105 KO 小鼠肠道菌群组成发生改变，Firmicutes 减少，Proteobacteria 和 Bacteroidetes 比例增加。

肠道屏障主要由黏液和上皮细胞组成，上皮细胞的紧密连接对于维持肠道物理屏障至关重要。在本研究中，Tas2r105 基因敲除的小鼠在 DSS 处理后，结肠上皮中 occludin 和 ZO - 1<