探秘克氏锥虫能量代谢新途径：L - 丝氨酸和 L - 苏氨酸的关键作用

《mSphere 3.7》：The role of l-serine and l-threonine in the energy metabolism and nutritional stress response of Trypanosoma cruzi

本文揭示克氏锥虫可利用 L - 丝氨酸（L-Ser）、L - 苏氨酸（L-Thr）和甘氨酸（Gly），其代谢对虫体生存至关重要。

　　

引言

克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）是查加斯病的病原体，在其生活周期中会在不同宿主的多种环境间转换，如哺乳动物宿主细胞的细胞质、血液以及锥蝽消化道的不同区域。为了在这些环境中生存，克氏锥虫会重新编程自身代谢，根据环境中营养物质的丰富程度，代谢碳水化合物、氨基酸和脂肪酸等多种碳 / 能量来源。

在克氏锥虫所占据的大多数环境中，L - 丝氨酸（L-Ser）、L - 苏氨酸（L-Thr）和甘氨酸（Gly）几乎无处不在。尽管如此，对这些氨基酸在该寄生虫体内代谢的深入研究却很少。已有研究表明，L-Ser 可能参与生物能量代谢，能触发二氧化碳（CO₂）的产生；在相关生物布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中，L-Thr 参与线粒体代谢也得到了充分证实；虽然没有证据表明 Gly 参与这些生物的能量代谢，但它的碳可能通过丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的可逆活性参与 L-Ser 的形成。因此，探究这三种氨基酸在克氏锥虫生物能量代谢和应对营养应激（NS）中的作用具有重要意义。

结果

1. 克氏锥虫无鞭毛体从细胞外介质转运 L-Ser、L-Thr 和 Gly：研究人员首先对 L-Ser、L-Thr 和 Gly 的摄取进行了研究。他们将寄生虫与放射性标记的氨基酸孵育，发现这三种氨基酸的摄取数据符合指数衰减函数，且在 10 分钟内呈近似线性，因此选择 3 分钟来测量初始摄取速度（V₀）。通过将无鞭毛体与不同浓度的氨基酸孵育并拟合米氏方程，得到了三种氨基酸的米氏常数（K_M）和最大反应速度（V_max）。

随后的交叉竞争实验表明，L-Ser、L-Thr 和 Gly 相互竞争，支持它们共享一个转运系统的假设。此外，研究人员还发现，结构相关的氨基酸会部分抑制 L-Ser 的转运，而结构不相似的氨基酸则对其影响不显著。2. L-Ser 摄取驱动力的测定：为了探究细胞内 ATP 水平和质子梯度对 L-Ser 转运系统的影响，研究人员进行了一系列实验。用寡霉素 A 处理寄生虫，导致细胞内 ATP 耗尽，结果发现 L-Ser 摄取减少了约 40.3%。用质子载体羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理细胞，它会破坏质子梯度并耗尽细胞内 ATP，研究人员通过添加寡霉素 A 来区分这两种效应，结果表明 L-Ser 的转运是一个依赖质子梯度的过程。3. L-Ser 摄取的热力学分析：在不同温度下测量 L-Ser 摄取的V_max，发现其在 40°C 时达到最大值。通过计算得到的Q₁₀值为 1.948，利用阿伦尼乌斯方程计算出的活化能（E_a）为 51.2 ± 2.4 kJ/mol，还估算出每个细胞的转运体数量约为 6 × 10⁴个活性位点。4. 寄生虫不同发育阶段 L-Ser 摄取的调节：研究人员在寄生虫的不同发育阶段测量 L-Ser 的摄取活性，包括细胞内阶段（无鞭毛体和细胞内无鞭毛体样阶段）、昆虫媒介中的阶段（无鞭毛体和循环后期锥鞭毛体）以及脊椎动物血液中的阶段（细胞衍生的锥鞭毛体）。结果显示，L-Ser 的转运在寄生虫的生命周期阶段中存在差异，细胞内无鞭毛体样阶段摄取的 L-Ser 约为无鞭毛体的五倍，而循环后期锥鞭毛体和血液中的锥鞭毛体摄取量则比无鞭毛体少五倍。5. L-Ser、L-Thr 和 Gly 参与克氏锥虫无鞭毛体对营养应激的抵抗：在研究这些氨基酸对营养应激抵抗的作用时，研究人员将细胞在补充或不补充氨基酸的磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育，以 L - 组氨酸（L-His）作为生存对照。结果发现，在 48 小时的孵育中，只有 L-Thr 能维持细胞活力在阳性对照水平；而在 72 和 96 小时的孵育中，Gly 和 L-Ser 能显著提高细胞活力。此外，增殖恢复实验表明，L-Ser、L-Thr 和 Gly 能维持无鞭毛体在营养应激后的增殖能力。6. 丝氨酸和苏氨酸对无鞭毛体生物能量学的作用：研究人员用放射性标记的 L-Ser、L-Thr 和 Gly 孵育无鞭毛体，发现 L-Ser 和 L-Thr 能被分解为 CO₂，而 Gly 则不能。计算代谢物摄取与 CO₂产生通量的关系后发现，3 小时孵育后，65.1% 的 L-Ser 和 21% 的 L-Thr 的放射性碳被转化为¹⁴CO₂。

高分辨率呼吸实验表明，L-Ser 和 L-Thr 能触发氧气（O₂）消耗，且与 L-His 类似，能促进 ATP 合成。此外，L-Ser 能建立和维持线粒体膜电位（ΔΨ_m），且这种作用可被线粒体丙酮酸载体（MPC）抑制剂逆转，表明 L-Ser 转化为丙酮酸是其参与 ATP 合成的主要代谢途径。7. 外代谢组学分析确定 L-Ser 代谢的排泄产物：通过定量¹H-NMR 分析研究 L-Ser 代谢的排泄产物，结果显示，L-Ser 代谢的主要排泄产物按数量排序为 Gly、丙氨酸（Ala）、乙酸盐，且与无外源碳源的寄生虫相比，琥珀酸盐的排泄减少。这进一步证实了 L-Ser 在克氏锥虫中的代谢可能通过转化为丙酮酸进行。研究人员还在无鞭毛体可溶性提取物中检测到 L-Ser/L-Thr 脱水酶活性，并克隆、表达和纯化了编码该酶的基因产物，确认了其活性。

讨论

克氏锥虫在消耗完葡萄糖后，可利用多种氨基酸和脂肪酸作为碳源和能源，本研究表明 L-Ser 和 L-Thr 也可作为主要的碳源和能源，而 Gly 可参与代谢但不提供能量。克氏锥虫缺乏 L-Ser 和 L-Thr 的从头合成途径，依赖转运活动获取这些分子。

1. L-Ser、L-Thr 和 Gly 的摄取由共享的 H⁺/ATP 驱动的转运系统完成：克氏锥虫在其生命周期中会接触到 L-Ser、L-Thr 和 Gly，这些氨基酸的转运系统属于 AAAP 家族。L-Ser 和 L-Thr 的K_M值与其他一些氨基酸相似，Gly 的K_M值也与部分氨基酸类似。L-Ser 摄取的V_max在 25°C 至 40°C 之间呈指数增加，这表明环境温度可能是这些氨基酸摄取的自然调节因素。此外，L-Ser 摄取在寄生虫的不同生命周期阶段存在差异，反映了其在不同阶段对这些氨基酸的需求不同。
2. L-Ser 和 L-Thr 在无鞭毛体中完全分解为 CO₂并刺激氧化磷酸化：与 Gly 不同，L-Ser 和 L-Thr 能分解为 CO₂，维持细胞内 ATP 水平和呼吸。研究排除了 Gly 在实验条件下通过某些途径产生 CO₂的可能性，同时也支持了锥虫缺乏经典 L-Ser 从头合成途径的观点。L-Ser 通过 MPC 进入线粒体，可转化为丙酮酸，为三羧酸循环（TCA 循环）提供碳源，从而参与氧化磷酸化（OxPhos）。
3. 克氏锥虫无鞭毛体具有丝氨酸和苏氨酸脱水酶活性：在大多数真核细胞中，L-Ser 和 L-Thr 的分解代谢分别通过脱水和脱氨作用产生丙酮酸和 2 - 氧代丁酸。在克氏锥虫无鞭毛体的可溶性提取物中发现了这两种脱水酶活性。L-Thr 的碳可作为其他酶的底物，参与乙酸盐和脂肪酸的生物合成。L-Ser 和 L-Thr 的分解代谢可产生乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）和乙酸盐，这不仅可以通过 OxPhos 产生 ATP，还可能通过底物水平磷酸化产生 ATP。此外，L-Ser 喂养的寄生虫排出 Gly 可能是一种渗透调节机制。

综上所述，L-Ser、L-Thr 和 Gly 可通过共享的 H⁺/ATP 依赖转运系统被细胞摄取，有助于维持营养应激期间的细胞稳态，为无鞭毛体的增殖提供条件。L-Ser 和 L-Thr 可进一步氧化产生 CO₂，触发 O₂消耗，维持线粒体膜电位，并通过 OxPhos 为 ATP 合成提供能量。研究人员根据实验结果和文献资料，提出了 L-Ser 和 L-Thr 的能量代谢模型。4. 材料和方法

• 试剂：L-[3-¹⁴C]Ser、L-[U-¹⁴C] Thr 和 [U-¹⁴C] Gly 购自美国放射性标记化学公司，其他试剂购自 Sigma 公司。
• 寄生虫：克氏锥虫 CL 株克隆 14 无鞭毛体在添加 10% 胎牛血清的肝浸液胰蛋白胨（LIT）培养基中培养，其他发育阶段的寄生虫通过特定方法获得，如循环后期锥鞭毛体通过营养应激和分化获得，血液中的锥鞭毛体通过感染中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K₁）获得，无鞭毛体和细胞内无鞭毛体样阶段通过裂解感染的宿主细胞获得。
• 转运实验：转运实验按照先前描述的方法进行，通过添加放射性标记的氨基酸，在特定时间后终止反应并洗涤，测量放射性来计算氨基酸的摄取量。竞争实验在特定浓度下进行，评估其他氨基酸对目标氨基酸摄取的影响。同时，研究人员还通过添加 CCCP 和寡霉素 A 等试剂，探究质子梯度和 ATP 对 L-Ser 摄取的影响。
• 分析转运实验数据：通过特定公式计算运输的放射性标记氨基酸的每分钟衰变数（dpm）和细胞摄取的氨基酸量。
• 活力和增殖恢复实验：将无鞭毛体在补充或不补充氨基酸的 PBS 中孵育，然后用刃天青试剂评估细胞活力，或转移到 LIT 培养基中评估增殖恢复能力。
• ΔΨ_m的定量：对无鞭毛体进行处理后，用荧光分光光度计测量番红荧光，通过构建校准曲线并根据能斯特方程估算 ΔΨ_m。
• 通过¹H-NMR 分析定量排泄代谢物：收集无鞭毛体，饥饿后在有或无 L-Ser 的条件下孵育，收集上清液冻干后进行¹H-NMR 光谱分析，计算代谢物浓度。
• 使用 L-Ser、L-Thr 和 Gly 的 ATP 恢复实验：将寄生虫饥饿后，在有或无特定氨基酸的条件下恢复，用荧光素酶测定法测定细胞内 ATP 浓度。
• CO₂产生测量：将无鞭毛体与放射性标记的氨基酸孵育，用浸泡 KOH 的滤纸捕获产生的 CO₂，通过闪烁计数器测量。
• 耗氧实验：将无鞭毛体营养应激后，在有或无特定氨基酸的条件下恢复，添加到呼吸缓冲液中，用高分辨率氧电极测量耗氧率。
• 重组 TcSer/ThrDH 的表达和纯化：在大肠杆菌中表达重组 TcSer/ThrDH，通过镍亲和层析纯化，用 Bradford 法定量，透析后进行 SDS-PAGE 分析。
• 统计分析：使用 GraphPad Prism 10 进行曲线拟合、回归、标准差计算和统计分析，所有实验至少进行三次生物学重复。

5. 致谢：研究人员感谢 Paul Michels 教授对本文的审阅和建议。本研究得到了多个基金的支持，包括圣保罗研究基金会（FAPESP）、巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）、法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家研究机构（ANR）、卓越实验室（LabEx）和法国医学研究基金会（FRM）等。此外，还介绍了参与研究的人员及其在研究中的贡献。