鼻腔初免 - 皮下加强的三价 OMV 疫苗：牙周炎防治新希望

《mSphere 3.7》：Assessment of periodontitis vaccine using three different bacterial outer membrane vesicles in canine model

本文研究发现三价细菌外膜囊泡（OMV）疫苗经鼻腔初免 - 皮下加强方案，可在犬中引发强大黏膜免疫反应。

　　### 牙周炎现状与研究背景
牙周炎是一种慢性多因素炎症性疾病，与牙周袋内的微生物群落失调密切相关，最终可能导致牙齿脱落，对咀嚼功能、美观和生活质量产生负面影响。2017 年，全球严重牙周炎的年龄标准化患病率达 9.8%，患病人数高达 0.8 亿。在牙周炎的众多致病因素中，多种细菌发挥着重要作用，其中牙龈卟啉单胞菌（Pg）和齿垢密螺旋体（Td）作为厌氧革兰氏阴性牙周致病菌，不仅与口腔微生物群落失调紧密相连，还与糖尿病、心血管疾病和癌症等多种口腔外疾病存在关联。

在牙周炎研究中，实验动物模型的选择至关重要。小鼠因操作简便、成本低等优势常被用于相关研究，但由于其不会自发患牙周炎，无法用于评估疫苗疗效。相比之下，犬与人类生活环境相似，且能自然发生与人类相似的牙周疾病，同时在犬体内检测到包括 Pg 和 Td 在内的多种人类牙周致病菌，因此犬是研究牙周炎的理想动物模型。

疫苗作为预防和控制传染病的有效手段，在牙周炎防治领域也备受关注。细菌外膜囊泡（OMV）作为一种新型疫苗平台，具有独特优势。OMV 是纳米级的蛋白脂质体，不仅携带病原体特异性抗原，还包含病原体相关分子模式，如脂多糖（LPS）、脂蛋白、肽聚糖和 DNA/RNA 等，能够通过与宿主免疫系统相互作用引发免疫反应。例如，鞭毛缺陷的益生菌大肠杆菌衍生物（EcNΔflhD）来源的 OMV 已被证实可作为新型纳米颗粒佐剂和递送平台。此前研究表明，鼻腔接种 Pg OMVs 可在小鼠中引发黏膜免疫反应，若与合适的黏膜佐剂联合使用，甚至能在口腔中实现灭菌免疫。不过，Pg OMVs 在小鼠中自佐剂性较差，需要强佐剂来激发强大的 Pg 特异性免疫反应，这一情况在犬和灵长类动物中可能同样存在。

材料与方法

1. 细菌菌株与培养条件：实验选用多种细菌菌株，包括 Pg 菌株 ATCC 33277 及其同源三价 gingipain 突变株 KDP981、牙龈卟啉菌（Pgul）菌株 ATCC 51700、唾液卟啉菌（Psal）菌株 ATCC 49407、伴放线聚集杆菌（Aa）菌株 Y4、Td 菌株 ATCC 35405 以及 EcNΔflhD。这些菌株分别在特定的培养基中，于厌氧或需氧条件下培养。
2. OMV 的分离与表征：采用 PVDF 膜过滤和超速离心法分离牙周致病菌的 OMV，利用甘氨酸诱导法分离 EcNΔflhD 的 OMV。对分离得到的 OMV 进行 Bradford 分析、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察、SDS-PAGE 分析以及纳米流式细胞术（nFCM）检测，以确定其蛋白质含量、形态、蛋白谱和粒径分布。
3. 内毒素检测：运用鲎试验，以大肠杆菌 O111:B4 的 LPS 为标准，比较不同物种 OMV 的内毒素活性。
4. 小鼠实验：选用 6 - 8 周龄的雌性 BALB/c 小鼠进行实验。实验设置不同的疫苗组合，通过鼻腔接种疫苗，在第 8 周采集血清和唾液样本，采用全细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）检测样本中针对多种牙周致病菌和 EcNΔflhD 的抗体水平。同时，进行皮下注射 OMV 的毒性评估，观察小鼠注射部位的局部反应。
5. 比格犬实验：购买 8 只 7 周龄的比格犬，将其分为生理盐水对照组和三价 OMV 疫苗实验组。通过皮下或鼻腔途径给比格犬接种疫苗，皮下注射剂量为每只 OMV 样本 250μg，鼻腔接种剂量为 50μg（第一、二、三次免疫）或 200μg（第四次免疫）。在不同时间点采集血清、唾液、粪便、眼洗液、鼻咽拭子、口腔拭子等多种样本，用于 ELISA 检测、微生物组分析和 DNA 提取。在实验结束时，对比格犬实施安乐死，并采集更多组织样本进行检测。
6. 细菌 DNA 提取、实时荧光定量 PCR 与宏基因组分析：从比格犬的唾液和粪便样本中提取细菌 DNA，采用 TaqMan - based 实时荧光定量 PCR 检测 Pg、Pgul、Td 等细菌的数量。运用基于 16S rRNA 扩增子的宏基因组分析方法，对唾液和粪便中的微生物群落进行检测，分析其多样性和组成。
7. 血清敏感性试验：通过 Pg 生长抑制试验，检测比格犬血清样本对野生型 Pg 菌株 ATCC 33277 和 gingipain 缺陷株 KDP981 生长的影响，评估血清的抗菌活性。
8. 统计分析：采用 Mann - Whitney U 检验或单因素方差分析（ANOVA）结合 Dunnett’s 多重比较检验对实验数据进行统计分析，在线性判别分析效应大小（LEfSe）分析中，则结合 Mann - Whitney U 检验、ANOVA 和 Kruskal - Wallis 检验进行统计。

实验结果

1. 小鼠鼻腔接种三价 Pg/Td/EcNΔflhD OMV 疫苗的效果：FE-SEM 分析显示，所有纯化的 OMV 均呈现纳米级球形结构，直径在 40 - 100nm 之间，且不同菌株来源的 OMV 表面外观存在差异。免疫实验结果表明，单独使用 Pg/Td OMVs 进行鼻腔免疫，无法诱导小鼠产生足够的针对相应病原体的抗体；而添加 Aa OMVs、Psal OMVs 或 EcNΔflhD OMVs 作为佐剂后，能显著增强 Pg 和 Td 特异性抗体的产生。其中，添加 EcNΔflhD OMVs 作为佐剂时，诱导的针对 Pg 的体液免疫反应最为强烈，同时该三价疫苗还能诱导产生针对 Pgul 的交叉反应抗体。
2. 比格犬接种三价 Pg/Td/EcNΔflhD OMV 疫苗的效果：nFCM 分析表明，比格犬实验中使用的 OMV 直径小于 100nm，与小鼠实验结果相符。在疫苗接种初期，三剂同源鼻腔免疫未能有效激发比格犬的体液免疫反应；然而，在第 21 周进行皮下加强免疫后，比格犬体内针对 Pg 和 Td 的抗体水平显著提高，不仅在全身血液循环中，而且在口腔、眼睛、呼吸道等黏膜部位均检测到较高水平的特异性抗体。
3. OMV 疫苗对比格犬唾液微生物组的影响：宏基因组分析结果显示，在实验期间，OMV 疫苗虽未显著改变唾液微生物群落的 α 和 β 多样性，但改变了微生物的组成。在分类水平上，虽然未发现疫苗对牙周致病菌数量有明显影响，但 LEfSe 分析表明，生理盐水组和 OMV 疫苗组分别有 3 种和 35 种分类成分的相对丰度发生了显著变化，这表明 OMV 疫苗似乎主要影响口腔微生物群落的组成，而非胃肠道微生物群落。
4. OMV 疫苗在小鼠和比格犬中的安全性评估：鲎试验结果显示，不同菌株来源的 OMV 内毒素活性存在差异，其中 Td OMVs 的内毒素活性极低。在小鼠实验中，当注射剂量不超过 1μg 时，未观察到 OMV 的局部反应；在比格犬实验中，当剂量低于 4.7μg/kg 体重时，未出现不良反应，而剂量超过 12.1μg/kg 体重时，会引发发热、恶心呕吐、唾液分泌过多和全身不适等症状，但这些症状在第 4 天均消失并恢复正常。
5. Pg 的免疫逃逸机制：在体外实验中，比格犬血清样本对野生型 Pg 菌株的生长无抑制作用，但对 gingipain 缺陷株的生长有显著抑制作用。这表明 Pg 可能通过 gingipains 降解蛋白质分子（如保护性抗体和补体）来逃避比格犬的免疫系统，从而实现免疫逃逸。

讨论

本研究中使用的 OMV 直径在 10 - 100nm 之间，符合纳米颗粒疫苗的特征，能够引流到淋巴组织并激活免疫系统，在小鼠和比格犬模型中均证实了三价 Pg/Td/EcNΔflhD OMV 疫苗具有较强的免疫原性。

在抗原特性方面，Pg OMVs 是有效的黏膜免疫原和稳定的抗原递送系统，但自佐剂性较弱。研究发现 Pg 与 Pgul 在抗原性上相似，可能与它们利用相同的分泌系统修饰外膜蛋白有关。Td OMVs 含有多种具有免疫原性的蛋白，如 dentilisin 等，但在比格犬中确定 Pg 和 Td 的免疫显性抗原仍是未来研究的重要方向。

在免疫反应差异上，小鼠和比格犬对鼻腔免疫的反应不同。小鼠通过三剂同源鼻腔免疫可诱导强烈的唾液 SIgA 反应，而比格犬则需要皮下加强免疫才能有效增强免疫反应。这可能是由于比格犬口腔内的共生微生物群与小鼠不同，导致比格犬对鼻腔免疫产生免疫耐受。相比之下，皮下加强免疫能更直接地激活适应性免疫系统，从而引发更强的免疫反应。因此，鼻腔初免 - 皮下加强的免疫方案可能是在犬类和人类中诱导强大体液免疫反应的合理选择。

在疫苗效果评估方面，本研究由于实验周期较短，无法评估疫苗对牙周炎自发发展的预防效果。同时，疫苗对口腔微生物群的影响虽改变了群落组成，但未减少牙周致病菌的数量。这可能是由于疫苗接种时间较晚，或者是疫苗诱导的比格犬抗体效果不佳。针对这一情况，可考虑调整疫苗接种方案，如在更年轻时接种或采用母源疫苗，也可结合其他牙周治疗方法，如专业机械洁牙和抗菌治疗，以提高疫苗的有效性。此外，鉴于 gingipains 在 Pg 免疫逃逸中的作用，开发针对 gingipains 的治疗策略可能与疫苗开发同样重要。

总体而言，牙周炎严重影响人类健康和生活质量，新型牙周疫苗的研发意义重大。本研究的三价 OMV 疫苗策略虽取得了一定成果，但仍存在样本量较小和研究周期较短的局限性。未来需要开展更大规模的兽医临床试验，并进行长期随访，以进一步验证 OMV 疫苗的疗效。同时，还需在灵长类动物中进行研究，为后续的人体临床试验奠定基础，探索更有效的牙周炎防治方法。