佛罗里达海域有害藻华研究：探秘与Karenia brevis藻华相关的 RNA 病毒

《mSphere 3.7》：Diverse ssRNA viruses associated with Karenia brevis harmful algal blooms in southwest Florida

本文利用病毒宏基因组学等技术，研究佛罗里达海域与Karenia brevis藻华相关的 RNA 病毒，揭示其多样性与分布规律。

　　一、研究背景
有害藻华（Harmful algal blooms，HABs）是一种严重的海洋生态灾害，由多种浮游植物大量繁殖引发。其中，由鞭毛藻Karenia brevis形成的有害藻华，常被称为 “赤潮”，几乎每年都会在墨西哥湾东部沿海和近海水域爆发。这种藻华不仅会使水体变色，还会导致水体缺氧，严重影响海洋生态环境。
K. brevis能够产生短裸甲藻毒素（brevetoxins），这些毒素具有神经毒性或溶血活性。它们不仅会直接导致鱼类死亡，还会在食物链中传递，造成鱼类、鸟类和海洋哺乳动物的死亡，甚至引发人类的神经毒性贝类中毒（NSP）。此外，K. brevis细胞破裂释放的毒素还可能被气溶胶化，引发动物和人类的呼吸道刺激，给公共健康带来威胁。
K. brevis藻华对佛罗里达州的旅游业、渔业和公共卫生部门造成了重大的经济损失。为了减轻这些影响，佛罗里达州采取了多种监测和预测策略，包括建立 FWC 历史有害藻华数据库、运用专门的遥感技术和海洋环流模型等。然而，由于藻华的复杂性，准确模拟其动态变化仍然具有挑战性。
病毒与宿主的相互作用在有害藻华的生命周期中起着重要作用，可能影响藻华的发展和衰退。虽然已有研究表明病毒可以感染有害藻华物种，但与K. brevis藻华相关的病毒尚未被测序。本研究旨在利用病毒宏基因组学技术，识别和监测与佛罗里达州西南部海域K. brevis藻华相关的 RNA 病毒，为深入了解藻华动态和生物防治提供基础。

二、材料与方法

1. 病毒组制备：在 2021 年 4 月、6 月和 7 月，从佛罗里达州西南部的 11 个地点采集海水样本。每个样本采集 500mL 表面海水，过滤后将滤膜处理用于病毒样颗粒（VLPs）的纯化。一半滤液用于 RNA 病毒的鉴定，另一半用于 DNA 病毒的鉴定。之后，对纯化的 RNA 病毒进行 NGS 文库制备和测序。
2. 病毒组组装和序列分析：使用多种方法对测序数据进行处理和分析，包括序列修剪、组装、病毒序列识别、基因组注释和系统发育分析等。通过与 NCBI 数据库中的序列进行比对，确定病毒基因组的亲缘关系，并评估基因组的质量和完整性。
3. 引物设计：针对每个代表性病毒基因组，设计逆转录 PCR（RT-PCR）引物。通过序列搜索评估引物的特异性，并在梯度 PCR 中确定最佳退火温度。
4. RT-PCR：使用设计好的引物对 2021 年的 11 个样本、2022 - 2023 年的 43 个海水样本以及 62 个Karenia spp. 细胞培养样本进行 RT-PCR 检测，分析病毒基因组的存在情况。
5. 病毒多样性分析：利用 SimpleMappr 创建样本位置地图，从 FWRI 的有害藻华数据库获取K. brevis细胞计数数据。使用 R 语言和相关包对 RT-PCR 结果进行分析，计算病毒的 α 多样性和 β 多样性，并评估其与环境变量的相关性。
6. 多元回归：构建多元回归模型，分析预测变量（环境因素和病毒存在 / 不存在）与响应变量（α 多样性和K. brevis细胞计数）之间的关系，优化模型并检测共线性。

三、研究结果

1. 病毒基因组：从 11 个海水样本中组装出 12 个完整性≥80% 的病毒基因组。其中，4 个基因组与感染甲藻的未分类Riboviria病毒相似，8 个基因组与Picornavirales目和Marnaviridae科的浮游植物感染病毒相似。通过系统发育分析，将 6 个基因组归为Sogarnavirus属，1 个归为Bacillarnavirus属，1 个归为Marnavirus属。
2. 读取覆盖度和变异性：大多数病毒基因组仅在 2021 年 6 - 7 月采集的 Pool2 样本中检测到。不同病毒基因组在不同样本中的覆盖度不同，且平均变异性与覆盖度通常呈正相关。
3. RT-PCR 检测：设计的引物对检测目标序列的灵敏度高于病毒组测序。在 2022 - 2023 年的样本中，至少一种病毒基因组在大部分样本中被检测到，其中Sogarnavirus sp. 和Chaetarnavirus 2分布最广。
4. 病毒多样性：α 多样性在不同年份、季节和月份存在显著差异，夏季样本的 α 多样性最高，且与K. brevis细胞计数呈正相关。β 多样性与纬度、经度、年份、季节、月份和K. brevis细胞计数类别显著相关。在Karenia spp. 细胞培养样本中未检测到病毒序列。

四、讨论
本研究首次对与K. brevis藻华相关的 RNA 病毒多样性进行了分析，发现这些病毒群落复杂且动态变化。大多数组装的病毒基因组属于Marnaviridae科，其宿主包括常见的浮游植物。此外，还发现了与未分类Riboviria相关的新病毒类群，但它们的宿主和生态功能仍有待进一步研究。
研究表明，病毒在浮游植物动态和细胞死亡中起着重要作用，可能影响藻华的发展。未来需要对K. brevis藻华及其微生物和病毒群落进行长期监测，并开展机制研究，以阐明病毒在藻华生态中的作用以及它们对环境因素（如气候变化）的响应。

本研究为深入了解K. brevis藻华相关病毒提供了重要信息，为未来的研究和生物防治策略的开发奠定了基础。