水稻恶苗病菌中腐胺与警报素 ppGpp 协同调控致病力的新发现

《mSphere 3.7》：Alarmone ppGpp modulates bacterial motility, zeamine production, and virulence of Dickeya oryzae through the regulation of and cooperation with the putrescine signaling mechanism

本文揭示警报素 ppGpp 调控腐胺合成运输，二者协同影响水稻恶苗病菌（D. oryzae）致病力。

　　### 水稻恶苗病菌研究背景
在植物病原菌的世界里，迪基氏菌属（Dickeya）的大多数成员都是危险分子，能让植物患上软腐病或维管束萎蔫病，严重影响农作物和观赏植物的生长，在重要植物病原菌榜单上名列前茅。其中，水稻恶苗病菌（D. oryzae）是引发水稻根腐病的 “罪魁祸首”，它的 “作案手段” 丰富多样，能分泌大量植物细胞壁降解酶（PCWDEs），还拥有细菌运动性和植物毒性玉米赤霉烯酮（zeamine）这两大 “凶器”，在入侵水稻种子的过程中发挥关键作用，严重破坏水稻生长。

此前的研究发现，D. oryzae的细菌运动性和 zeamine 的产生受到多种因素的调控，比如群体感应系统、腐胺（putrescine）信号系统、环二鸟苷酸（c-di-GMP）、转录调节因子、双组份系统以及 RNA 伴侣 Hfq 等。在这些因素中，腐胺信号系统在调节细菌运动性方面表现突出，而 RNA 伴侣 Hfq 则对细菌运动性和 zeamine 的产生都有重要影响。

腐胺是一种存在于所有活细胞中的脂肪烃分子，它在细胞内的 “稳定状态” 由合成、分解代谢和运输共同维持。在细菌中，腐胺的合成主要有两条途径：一条是从鸟氨酸出发的 ODC 途径，由 SpeC 蛋白催化鸟氨酸脱羧生成腐胺；另一条是以精氨酸为起点，在精氨酸脱羧酶 SpeA 的作用下形成胍丁胺，再由胍丁胺脲水解酶 SpeB 转化为腐胺。有趣的是，不同细菌中这两条途径对腐胺平衡的贡献各不相同。在大肠杆菌中，ODC 途径是腐胺合成的 “主力军”，另一条途径则起辅助作用；而在D. oryzae中，SpeA 依赖的途径才是腐胺合成以及调节细菌运动性和毒力的关键，由 SpeC 介导的 ODC 途径反而不是必需的。此外，多种核苷酸会影响腐胺合成途径中关键酶的活性，而且腐胺和亚精胺还能抑制 SpeA 的表达。在D. oryzae等革兰氏阴性菌中，PotFGHI 和 PlaP 转运系统参与了腐胺的摄取，不过，D. oryzae中 SpeA 依赖的腐胺合成及其转运的调控机制仍是个未解之谜。

警报素（p）ppGpp 是细菌在营养压力（如氨基酸或脂肪酸饥饿）下，由 RelA/SpoT 同源家族（RSH）的蛋白质产生的 “应急信号”。RelA 能从 GTP/GDP 和 ATP 合成（p）ppGpp，SpoT 则是一种双功能酶。（p）ppGpp 可不只是应对营养压力的 “信号兵”，在氧气变化、pH 值下降、黑暗等多种信号刺激下，它也会在细菌体内积累。而且，它还能通过调节群体感应信号降解、细胞壁降解酶产生和 III 型分泌系统表达等方式，调控植物病原菌的致病性。

腐胺合成对摄取系统基因表达的抑制作用

研究人员首先聚焦于腐胺对其摄取系统基因表达的影响。他们以D. oryzae EC1 野生型菌株和speA基因缺失突变体（?speA）为研究对象，通过半定量逆转录 PCR（RT-PCR）技术测量potF和plaP的表达水平。结果令人惊讶，?speA中potF和plaP的转录水平分别比野生型菌株 EC1 高出 5.8 倍和 6.3 倍。当向?speA中添加终浓度为 0.1 mM 的外源腐胺后，potF和plaP的转录水平大幅下降，几乎与野生型菌株 EC1 相当。

为了进一步验证这一结果，研究人员构建了携带gfp报告基因的菌株，让gfp分别受potF和plaP启动子的控制，然后将这些报告菌株转入野生型菌株 EC1 和突变体?speA中。在添加或不添加外源腐胺的培养条件下，测量并比较它们的相对荧光强度。结果显示，添加 0.1 mM 外源腐胺后，?speA（PpotF-gfp）和?speA（PplaP-gfp）的相对荧光强度显著降低，与 EC1（PpotF-gfp）和 EC1（PplaP-gfp）的水平相近。而且，外源腐胺对?speA中potF和plaP表达的抑制作用呈现剂量依赖性，在 0.02 - 0.1 mM 的浓度范围内，随着腐胺浓度的增加，抑制效果越发明显。这些实验结果清晰地表明，在D. oryzae EC1 中，由speA合成的腐胺信号会对腐胺摄取系统 PotFGHI 和 PlaP 的转录表达产生负调控作用。

警报素 ppGpp 对potF和plaP表达的抑制

接下来，研究人员探寻警报素 ppGpp 在这一调控过程中的角色。他们利用基于 mariner 的转座子系统对报告菌株 EC1（PpotF-gfp）进行突变，在筛选了 15,000 个突变体后，发现了一个转座子插入突变体 T1536，其转座子插入到了（p）ppGpp 生物合成基因relA的编码序列中，且该突变体的相对荧光强度比 EC1（PpotF-gfp）更高。

为深入研究relA对potF和plaP表达的调控作用，研究人员构建了?relA（PpotF-gfp）和?relA（PplaP-gfp）报告菌株。实验结果显示，这两个报告菌株的相对荧光强度均高于野生型菌株 EC1 中相应的报告菌株，RT-PCR 分析也表明，?relA中potF和plaP的转录水平显著高于野生型菌株 EC1 和互补菌株?relA（relA）。这一系列实验充分说明，relA参与了对potF和plaP表达的调控。

由于 RelA 是警报素（p）ppGpp 的合成酶，研究人员进一步探究 ppGpp 对potF和plaP表达的影响。他们向?relA（PpotF-gfp）和?relA（PplaP-gfp）中添加外源 ppGpp，结果发现，添加 0.05 mM ppGpp 后，?relA中potF和plaP的表达水平显著降低，与野生型菌株 EC1 中的水平相当。这明确表明，由 RelA 合成的警报素 ppGpp 能够抑制D. oryzae EC1 中腐胺摄取系统基因potF和plaP的表达。

ppGpp 通过调节speA表达调控potF和plaP

既然 ppGpp 和腐胺都能抑制potF和plaP的表达，研究人员推测 ppGpp 和腐胺的生物合成之间存在某种调控联系，共同影响potF和plaP的表达。为了验证这一假设，他们构建了多种携带gfp报告基因的菌株，比较不同菌株中相关基因的相对荧光强度。

实验结果发现，EC1（PrelA-gfp）和?speA（PrelA-gfp）的相对荧光强度相近，这意味着腐胺生物合成对relA的表达没有明显影响；而 EC1（PspeA-gfp）的相对荧光强度则显著低于?relA（PspeA-gfp），不过，当向?relA（PspeA-gfp）中添加终浓度为 0.05 mM 的外源 ppGpp 后，其相对荧光强度又能恢复到一定水平。同时，研究人员还发现，突变体?relA中的腐胺细胞内浓度比野生型菌株低约两倍。这些结果表明，由relA合成的警报素 ppGpp 能够调节speA的表达，进而影响D. oryzae EC1 细胞内的腐胺含量。

此外，研究人员还发现腐胺会影响警报素 ppGpp 对potF和plaP表达的调控。向?relA（PpotF-gfp）和?relA（PplaP-gfp）中添加终浓度为 0.1 mM 的外源腐胺后，它们的相对荧光强度分别降低到与野生型菌株相近的水平。综合这些实验结果，可以得出结论：RelA 合成的 ppGpp 通过调节speA的表达来调控腐胺的生物合成，进而影响potF和plaP的表达。

ppGpp 通过腐胺信号调节细菌运动性

以往研究表明腐胺对D. oryzae的游泳和群体运动性有重要贡献，研究人员推测警报素 ppGpp 对speA表达的调节也可能影响细菌的运动性。为了验证这一推测，他们在半固体琼脂平板上比较了野生型菌株 EC1 和突变体?relA的游泳和群体运动能力。

实验结果显示，?relA的游泳和群体运动能力明显受损，不过，通过转座表达relA，或者向培养基中添加终浓度为 0.1 mM 的 ppGpp 或腐胺，都能使突变体的运动能力得到恢复。这一系列实验结果充分表明，在D. oryzae EC1 中，警报素 ppGpp 通过调节腐胺信号通路来调控细菌的游泳和群体运动性。

ppGpp 与腐胺协同调节细菌运动性和 zeamine 产生

除了上述的层级调控关系，研究人员还想知道 ppGpp 和腐胺在调节D. oryzae的致病性状方面是否存在协同作用。他们对relA和speA进行双敲除，观察其对细菌生长、游泳运动性和 zeamine 产生的影响。

实验发现，relA和speA双敲除并不影响D. oryzae EC1 的生长，但会显著降低细菌的游泳运动性。不过，在双敲除突变体中表达relA或speA，或者添加外源 ppGpp 或腐胺，都能使游泳运动性得到恢复，这表明 ppGpp 和腐胺在调节游泳运动性方面存在协同效应。

在 zeamine 产生方面，研究人员发现，单独敲除relA或speA对 zeamine 的产生没有明显影响，但relA和speA双敲除后，zeamine 的产量显著下降。而且，通过转座表达relA或speA，或者添加外源 ppGpp 或腐胺，都能使 zeamine 的产量得到恢复。同时，研究人员检测了 zeamine 生物合成关键基因zmsD和zmsE的转录水平，发现它们在relA-speA双敲除突变体中的转录水平明显低于野生型菌株，而在单敲除突变体中则没有明显变化。这些结果表明，ppGpp 和腐胺通过调节zms基因的表达，对 zeamine 的产生发挥协同调节作用。

ppGpp 与腐胺协同调节依赖于hfq对 zeamine 产生的调控

为了深入探究 ppGpp 和腐胺调节 zeamine 产生的分子机制，研究人员对已知的 zeamine 产生调节因子进行转录表达分析。此前研究表明，sRNA 伴侣 Hfq 参与了D. oryzae EC1 的游泳运动性和 zeamine 产生过程。在本研究中，逆转录定量 PCR（RT-qPCR）分析显示，relA-speA双敲除突变体中hfq的表达水平比野生型菌株低 1.9 倍，而添加外源 ppGpp 或腐胺后，hfq的表达水平能够恢复。

进一步实验发现，在relA-speA双敲除突变体中转座表达hfq，可以挽救 zeamine 产生的缺陷。这些实验结果揭示了腐胺和 ppGpp 信号通过调节hfq的转录表达，协同调控 zeamine 的产生。

ppGpp 和腐胺控制D. oryzae EC1 对水稻种子的致病性

由于游泳运动性和 zeamine 产生是D. oryzae EC1 抑制水稻种子萌发的主要毒力因素，而 ppGpp 和腐胺在调节细菌运动性和 zeamine 产生方面发挥重要作用，研究人员推测它们可能共同调节D. oryzae EC1 对水稻种子的致病性。

他们用野生型菌株 EC1、突变体?relA、?speA和?relA?speA进行水稻种子萌发实验。结果显示，单独敲除relA或speA都会降低细菌抑制水稻种子萌发的能力，而relA和speA双敲除后，在各个细菌接种浓度下，水稻种子的抑制率下降更为显著。这充分揭示了 ppGpp 和腐胺的协同作用对D. oryzae EC1 致病性的重要贡献。

研究总结与展望

本研究全面揭示了警报素 ppGpp 在D. oryzae EC1 中对腐胺摄取系统转录调控的机制，它通过控制 SpeA 介导的腐胺生物合成来实现这一调控。同时，研究强调了警报素 ppGpp 和腐胺协同调控 Hfq 依赖的细菌毒力的重要性。

在细菌细胞内，多胺稳态对细菌的生存和毒力至关重要。不同细菌在维持多胺稳态方面采取了不同的策略，D. oryzae通过反馈抑制机制，根据细胞内腐胺的含量调节腐胺摄取系统的表达。而警报素 ppGpp 对不同细菌中腐胺生物合成的调节方式也有所不同，在大肠杆菌中它对 SpeC 依赖的途径有负向影响，在D. oryzae中则正向调节 SpeA 依赖的途径。

此外，本研究还发现 ppGpp 和腐胺在调节D. oryzae的 zeamine 产生和致病性方面存在协同作用，且这种协同作用依赖于对hfq表达的调控。不过，relA-speA双敲除突变体的游泳运动性相对较高的原因还需要进一步研究探索。

警报素 ppGpp 和腐胺是细菌中广泛存在的化学信号，它们在不同细菌物种中的调控关系和协同作用对细菌生理和代谢的影响仍是未知领域。未来，深入研究这些问题将有助于我们更全面地了解细菌的致病机制，为开发新型抗菌策略提供理论依据，也为保障农业生产安全开辟新的道路。