鸡白痢研究新突破：宿主基因与肠道菌群的关键作用

《Microbiology Spectrum 3.7》：The host susceptibility/resistance-related genes and gut microbial characteristics in Salmonella pullorum-infected chickens

本文通过研究发现鸡白痢（Salmonella pullorum）感染与宿主基因、肠道菌群相关，为防控提供新方向。

　　### 鸡白痢：家禽健康的重大威胁
家禽在全球农业经济中占据重要地位，是人类获取蛋白质的主要来源之一。2024 年，全球禽蛋和禽肉产量分别达到约 92 亿和 1.03 亿吨。然而，家禽产业深受多种疾病困扰，鸡白痢便是其中极具威胁的细菌性疾病，由鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum，简称 S. pullorum）引发。

鸡白痢主要危害 20 日龄以下的雏鸡，发病率和死亡率颇高。S. pullorum 传播途径多样，既能垂直传播，通过公鸡精液或母鸡生殖道传递给后代；也能水平传播，病菌进入鸡肠道后大量繁殖，突破肠黏膜，借助树突状细胞转移至肠系膜淋巴结，进而侵入血液、肝脏、脾脏等器官，长期定植在肝脏和脾脏，使鸡成为带菌者，将感染传播给其他鸡。

当前，家禽生产中防控鸡白痢主要依靠两种方法：基于抗体检测的种鸡净化和使用抗生素。但这两种方法存在诸多问题，种鸡净化成本高昂且准确性有限，抗生素的使用则导致细菌耐药性增强和滥用问题。以往对鸡白痢的研究多聚焦于临床症状、流行病学特征和病原菌的致病基因，对宿主因素在感染过程中的作用关注较少。事实上，不同品种鸡甚至同一品种内不同个体对鸡白痢的易感性存在显著差异，这种差异可能与个体遗传因素有关。因此，探究宿主遗传基础对揭示鸡白痢感染的分子机制具有重要意义。

研究设计：多维度探索鸡白痢感染机制

本研究选用上海农业科学院畜牧兽医研究所的新浦东鸡，挑选出 23 只鸡白痢阳性鸡（6 只公鸡、17 只母鸡，29 周龄）和 98 只阴性鸡（12 只公鸡、86 只母鸡，29 周龄）。阳性公鸡与阳性母鸡交配得到 227 只阳性后代雏鸡，阴性公鸡与阴性母鸡交配得到 611 只阴性后代雏鸡。所有鸡饲养条件相同且未使用抗生素。实验选用中国农业科学院上海兽医研究所的 S. pullorum 标准菌株 SP1218 作为攻毒菌株，所有动物实验均遵循上海交通大学实验动物研究指南进行。

研究采用全血平板凝集试验检测新浦东鸡的 S. pullorum 抗体，以确定鸡群的感染状态。通过测定 S. pullorum 的半数致死剂量（LD₅₀），为后续攻毒实验提供合适剂量。具体操作是将 SP1218 菌株在平板上挑取单菌落划线培养，18 小时后收集细菌，用无菌 PBS 洗涤、低速离心，再用预冷 PBS 洗涤三次，最后重悬于 PBS 中。根据 OD₆₀₀值制备不同浓度梯度的菌悬液，分别为 5×10⁹、5×10⁸、5×10⁷、5×10⁶、5×10⁵CFU/mL 和 5×10⁴CFU/mL。将这些菌悬液分别以 0.2mL / 只的剂量肌肉注射到雏鸡腿部，采用改良 K?ber 法计算 LD₅₀。

攻毒实验中，选取 3 日龄雏鸡，按照 LD₅₀实验得到的剂量，将 SP1218 菌悬液以 0.2mL / 只的剂量肌肉注射到雏鸡腿部。实验期间，雏鸡自由采食，不使用抗生素和疫苗。每天记录鸡的死亡和存活情况，计算死亡率和存活率。攻毒实验结束后，采集肝脏、脾脏和盲肠内容物样本，储存于 -80°C 冰箱。

鸡白痢感染雏鸡的特征

通过全血平板凝集试验，确定了新浦东鸡群中 S. pullorum 的感染情况。对连续三次检测结果均为阳性和阴性的鸡进一步检测，在其新鲜血液或培养的粪便肛拭子溶液涂于 SS 琼脂培养基过夜培养后，均未检测到 S. pullorum。

在 LD₅₀测定实验中，选取 120 只雏鸡（60 只阴性后代雏鸡和 60 只阳性后代雏鸡），分别接种六种不同浓度的 SP1218 菌悬液。根据实验数据计算得出，适合攻毒实验的 LD₅₀为 6.3×10⁶CFU。

攻毒实验中，718 只 3 日龄雏鸡（167 只阳性后代雏鸡和 551 只阴性后代雏鸡）接受了 SP1218 菌悬液注射。攻毒后，部分雏鸡出现肛门糊肛现象，甚至因糊肛死亡。解剖死亡雏鸡发现，肝脏和脾脏有明显病变。感染后 13 天内，阳性后代雏鸡死亡率约为 16%（共 27 只死亡），阴性后代雏鸡死亡率约为 29%（共 159 只死亡），死亡高峰出现在感染后 3 - 7 天。

随机选取 100 只死亡和 3 只存活的阴性后代雏鸡肝脏样本进行检测，通过 PCR 在 89 份死亡样本和 1 份存活样本中检测到 SP1218。随机选取 3 份 PCR 条带样本进行胶回收和测序，结果证实肝脏中检测到的菌株为 SP1218。

收集肝脏和脾脏样本计算细菌载量，结果显示，死亡阳性后代雏鸡肝脏和脾脏的细菌载量分别为 9.4×10⁷CFU/g 和 4.6×10⁷CFU/g，死亡阴性后代雏鸡肝脏和脾脏的细菌载量分别为 3.1×10⁷CFU/g 和 2.6×10⁷CFU/g。其中，死亡阴性后代雏鸡肝脏细菌载量显著低于死亡阳性后代雏鸡（P < 0.01），脾脏细菌载量虽也低于死亡阳性后代雏鸡，但差异不显著。而 48 只存活雏鸡肝脏和脾脏的细菌载量过低，无法计数。

与易感性 / 抗性性状相关的显著遗传变异

选取 78 只肝脏检测到 SP1218 的死亡阴性后代雏鸡和 71 只存活阴性后代雏鸡，采集肝脏样本进行全基因组重测序。基于参考基因组的序列定位结果，在 149 个样本中检测到 31,047,097 个单核苷酸多态性（SNP）和 5,134,678 个插入缺失（InDel）。经过群体筛选，共获得 8,047,152 个 SNP 和 977,909 个 InDel。

使用 GEMMA 软件进行全基因组关联研究（GWAS），以死亡和存活作为表型。分析前，先用 PLINK 软件对 8,047,152 个 SNP 进一步筛选，筛选标准为：单个样本缺失率不大于 50%；单个位点缺失率不大于 20%；最小等位基因频率小于 0.05。

基于 SNP 计算群体遗传背景的主成分，结果显示死亡组和存活组的遗传背景无显著偏差。计算表型和基因型的相关矩阵后进行 GWAS，得到 3,616,707 个 SNP。绘制分位数 - 分位数图（Q - Q 图）和曼哈顿图，Q - Q 图左下角的位点表明模型合理，右上角显著性较高的位点可能是与性状相关的候选位点。曼哈顿图的阈值设定为 P = 1.38×10^-6，最终获得 195 个显著 SNP 和 79 个显著 InDel。这些显著 SNP 存在多个聚类现象，单条染色体上 7 个或更多 SNP 聚类的情况占显著 SNP 总数的 87%。例如，1 号、14 号、19 号、25 号、27 号和 31 号染色体上分别有 21、21、23、11、16 和 27 个显著 SNP 聚类。与雏鸡 S. pullorum 感染关联最显著的 SNP 位于 3 号染色体的 51,806,310bp 处。

与易感性 / 抗性性状相关的基因及其功能

对 195 个显著 SNP 进行基因注释，共鉴定出 60 个基因。与 S. pullorum 易感性 / 抗性性状关联最显著的 SNP 距离基因 GTF2H5（通用转录因子 IIH 亚基 5）约 155kb。1 号染色体上的一个 SNP 注释在 CNTN5（接触蛋白 5）的内含子上。19 号染色体上，一个 SNP 注释在 MYH7（肌球蛋白重链 7，心肌，β）的外显子上；12 个 SNP 注释在 ATP2A3（ATP 酶，Ca²⁺转运，普遍存在）的外显子上，其中 3,440,011bp 和 3,449,102bp 处的两个 SNP 为非同义突变，分别是外显子 8 中 G 到 C 的突变和外显子 15 中 T 到 G 的突变。26 号染色体上，7 个 SNP 位于 CACNA1S（钙电压门控通道亚基 α1S）的外显子上，276,599bp、276,604bp 和 276,614bp 处的 SNP 为非同义突变，分别是外显子 25 中 G 到 T、G 到 C 和 A 到 G 的突变。

对 79 个显著 InDel 进行注释，共注释到 41 个基因。最显著的位点位于 18 号染色体的 11,154,013bp 处，发生了 35 个碱基的缺失，最近的基因是 GRB2（生长因子受体结合蛋白 2）。3 号染色体上有两个 InDel，一个位于 11,882,630bp，注释在 PPP3R1（蛋白磷酸酶三调节亚基 B，α）的内含子上；另一个位于 31,492,722bp，注释在 TTC27（四肽重复结构域 27）基因的内含子上。

对这些基因进行富集分析，发现 27 个基因富集在 55 个京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路中，其中 11 个通路差异显著。最显著的是 CASP14 和 MLXIPL 参与非酒精性脂肪性肝病代谢（P = 0.0006）。此外，CACNA1S、ATP2A3 和 MYH7 参与心肌收缩（P = 0.0028）和心肌细胞肾上腺素能信号通路（P = 0.016）。GRB2、CACNA1S、RPS6KA 和 DUSP7 参与 MAPK 信号通路（P = 0.0229）。CASP14 参与细胞凋亡和 TNF 信号通路（P = 0.0322），还涉及百日咳（P = 0.0557）、军团菌病（P = 0.0557）、阿尔茨海默病（P = 0.101）和癌症相关通路（P = 0.2499）。CASP14 和 ABCF2 参与致病性大肠杆菌感染（P = 0.0792），CASP14 和 S100A10 参与沙门氏菌感染（P = 0.2076）。虽然部分通路差异不显著，但暗示 CASP14 可能是疾病的重要候选基因。

S. pullorum 感染改变细菌多样性

根据攻毒实验后的死亡和存活雏鸡情况，从测序样本中选取 78 只死亡阴性后代雏鸡中的 20 只（ND）、71 只存活阴性后代雏鸡中的 20 只（NS）、5 只死亡阳性后代雏鸡（PD）和 5 只存活阳性后代雏鸡（PS），收集这些雏鸡的盲肠内容物进行 16S rRNA 测序，分析 S. pullorum 感染后的肠道微生物特征。

通过比较 Chao1、Shannon、Faith's PD、Pielou's evenness 和 Good's coverage 等 α 多样性指数，评估 S. pullorum 感染对肠道微生物多样性的影响。结果显示，NS 组的微生物丰富度、多样性和均匀度高于 ND 组，而覆盖度则相反，其他组之间无显著差异。总体而言，S. pullorum 感染显著降低了死亡雏鸡肠道微生物的丰度和多样性。

比较雏鸡感染 S. pullorum 前后的肠道微生物多样性，感染前的雏鸡样本来自之前的研究，包括 40 只阴性后代雏鸡（N）和 40 只阳性后代雏鸡（P）。结果显示，NS 组的肠道微生物多样性和丰富度显著高于 N 组和 P 组，P 组和 PS 组之间无显著差异。这表明雏鸡在抵抗 S. pullorum 感染时，肠道微生物的丰度和多样性显著增加。

通过 β 多样性研究样本间物种组成的异质性，非度量多维尺度分析（NMDS）和主坐标分析（PCoA）显示，存活组和死亡组之间的微生物群落多样性差异较大，尤其是 NS 组和 ND 组之间，这与 α 多样性分析结果一致。

与鸡 S. pullorum 感染相关的肠道微生物群

分析感染 S. pullorum 雏鸡的肠道微生物组成发现，厚壁菌门（Firmicutes）是各实验组中最主要的菌门，在 ND 组中占比 79.08%，NS 组中占比 95.47%，PD 组中占比 90.51%，PS 组中占比 90.15%。变形菌门（Proteobacteria）为第二主要菌门，在 ND 组中占比 20.24%，NS 组中占比 3.95%，PD 组中占比 9.01%，PS 组中占比 5.99% 。

在属水平上，ND 组中丰度最高的菌属包括大肠杆菌 - 志贺氏菌属（Escherichia_Shigella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、毛螺旋菌属（Lachnoclostridium）、布劳特氏菌属（Blautia）、Sellimonas 属和梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）；NS 组中主要为 Fournierella 属、Eisenbergiella 属、Lachnoclostridium 属、Negativibacillus 属、肠球菌属（Enterococcus）、Subdoligranulum 属和扭链瘤胃球菌组（[Ruminococcus]_torques_group）；PD 组中链球菌属（Streptococcus）、扭链瘤胃球菌组、Blautia 属、Sellimonas 属、Clostridium_sensu_stricto_1 属、丹毒丝菌属（Erysipelatoclostridium）、真杆菌属（Eubacterium）、厌氧棒状菌属（Anaerostipes）和艰难梭菌属（Clostridioides）等菌属富集；PS 组中 Lactobacillus 属、Streptococcus 属、瘤胃球菌属（Ruminiclostridium_5）、Romboutsia 属和丁酸球菌属（Butyricicoccus）的丰度较高。

对多组间不同肠道微生物的分析显示，有 51 种细菌在四组间存在显著差异。在菌门水平，NS 组中 Firmicutes 的含量显著高于其他组（P < 0.05），ND 组中 Proteobacteria 的含量显著高于其他组（P < 0.05）。在属水平，与其他三组相比，ND 组中 Escherichia_Shigella 和克雷伯氏菌属（Klebsiella）的含量显著增加（P < 0.05）；NS 组中盲肠肠球菌（Enterococcus_cecorum）和乳酸乳杆菌（Lactobacillus_rennini）的含量显著高于其他组（P < 0.05）；PD 组中硫杆菌属（Thiobacillus）和氢嗜菌科（Hydrogenophilaceae）的含量显著升高（P < 0.01）；PS 组中阴道乳杆菌（Lactobacillus_vaginalis）、Erysipelatoclostridium_bacterium_ic1391 和假单胞菌属（Pseudomonas）的含量也显著高于其他组（P < 0.05）。

对比 ND 组和 NS 组发现，有 68 种细菌存在显著差异（P < 0.05）。其中，Lactobacillus 和 Escherichia_Shigella 在 ND 组中的丰度显著高于 NS 组，而 Eisenbergiella 和芽孢杆菌属（Bacillus）则相反（P < 0.05）。Lactobacillus 在 ND 组中的丰度也显著高于 PD 组，而 Eubacterium 和 Eggerthellaceae_CHKCI002 的情况则相反。PD 组中 Escherichia_Shigella、Eubacterium 和鲸杆菌属（Cetobacterium）的丰度显著高于 PS 组（P < 0.05），Eisenbergiella 和 Bacillus 在 NS 组中的丰度显著高于 PS 组（P < 0.05）。这些细菌可能是与 S. pullorum 感染相关的重要菌属。

比较感染前（P 组和 N 组）和感染后（PS 组和 NS 组）雏鸡的肠道微生物组成发现，感染前 P 组和 N 组中 Lactobacillus 的丰度较高。N 组中 Lactobacillus 和 Escher<