解析多重耐药鲍曼不动杆菌：传播溯源、耐药探秘与防控策略

《Microbiology Spectrum 3.7》：Epidemiological characteristics and antimicrobial resistance of extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii in ICU wards

本文对 56 株广泛耐药鲍曼不动杆菌（XDRAB）进行研究，揭示其传播规律、耐药机制及防控要点。

　　

一、研究背景：鲍曼不动杆菌的威胁与挑战

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Ab）作为一种革兰氏阴性杆菌，在自然界广泛分布，能够定植于人体多个部位。因其强大的黏附能力和在恶劣环境中的生存本领，它已成为医院获得性感染的重要病原体，对免疫功能低下的患者危害极大。

世界卫生组织将鲍曼不动杆菌列为极具威胁的 ESKAPE 病原体之一，这凸显了其耐药问题的严重性。广泛耐药鲍曼不动杆菌（extensively drug-resistant A. baumannii，XDRAB）的出现，更是让情况雪上加霜。XDRAB 对多种抗生素耐药，包括新一代抗菌药物，使得治疗选择极为有限，大大增加了患者的发病率和死亡率。

为有效应对这一挑战，细菌分子分型技术至关重要。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）和全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）是其中的关键技术。PFGE 可通过限制酶消化后分离大 DNA 片段，区分不同菌株，常用于医院感染追踪；WGS 则能提供细菌全基因组的详细序列信息，助力揭示耐药基因、移动元件以及菌株间的遗传关系。本研究综合运用这两种技术，深入剖析 XDRAB 的遗传特征和耐药机制。

二、研究方法：多技术联合探索 XDRAB 奥秘

1. 菌株来源与鉴定：研究人员从中国浙江省金华市中心医院多个 ICU 病房的临床标本中，筛选出 56 株非重复的 XDRAB 菌株。这些标本涵盖了痰液、血液、脑脊液、伤口分泌物等多种类型，且菌株均来自被诊断为严重医院获得性感染的患者，同时满足 XDR 的定义，即对至少三类抗生素耐药。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）对菌株进行鉴定，当鉴定分数超过 2.0 时，确保了准确的物种识别，并使用了质量控制菌株保证鉴定和检测程序的准确性。
2. 抗生素敏感性测试：采用 VITEK 2 Compact 系统进行抗生素敏感性评估，将细菌悬液调整至 0.5 McFarland 标准后加载到 GN - 335 卡上，16 - 20 小时后自动读取最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。对于亚胺培南、美罗培南和左氧氟沙星的 MIC，使用 E-test 方法进行确认；替加环素和多粘菌素则通过微量肉汤稀释法检测。对于 VITEK 2 系统产生的可疑结果，利用 Kirby - Bauer 方法进行验证。最终，依据临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南，将药敏结果分为敏感（sensitive，S）、中介（intermediate，I）或耐药（resistant，R）。
3. PFGE 分析：从存储在 - 80°C 的 XDRAB 菌株中挑取单菌落进行培养，调整浓度至 4.0 McFarland。样本经蛋白酶 K 处理后嵌入 1% Seakem Gold 琼脂糖凝胶，进行酶切和电泳 18 小时，随后用 GelRed 染色、水脱色并成像。利用 BioNumerics 软件进行聚类分析，设定相似度阈值为 80%，以此判断菌株是否为相同克隆。
4. 全基因组测序及数据分析：使用 MiniBEST 细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取 XDRAB 菌株的基因组 DNA。经 Illumina 测序平台进行 2×150 bp 双端测序，对提取的 DNA 进行片段化、末端修复、A 尾添加、接头连接和 PCR 扩增等操作。利用 Agilent 5400 系统评估文库质量，合格后进行测序，平均覆盖深度约 100×。使用 Fastp 软件对原始数据进行质量控制，去除低质量 reads、接头污染和含有超过 10% 不确定核苷酸的 reads。之后，运用 SPAdes 软件进行基因组组装，RASTtk 工具进行注释。借助 PUBMLST 平台进行多序列位点分型（multi - locus sequence typing，MLST）和核心基因组多位点序列分型（core - genome multi - locus sequence typing，cgMLST），利用 Resfinder 和 CARD RGI 工具识别耐药基因，VFanalyzer 检测毒力基因，Kaptive 分析荚膜多糖和脂寡糖位点，MobileElementFinder 鉴定移动元件。通过 BacWGSTdb 的 Clearcut 软件分析系统发育关系，Grapetree 可视化最小生成树。在基于 WGS 的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析中，以少于 20 个 SNP 差异判断菌株可能具有克隆起源，超过 100 个 SNP 差异则认为菌株遗传差异较大。

三、研究结果：XDRAB 的传播、耐药与遗传特征

1. 菌株分布与耐药情况：56 株 XDRAB 菌株分布在多个 ICU 病房，其中 ICU3 的菌株数量最多，有 24 株。标本来源中，痰液标本占比最大，有 44 份。药敏测试显示，所有菌株对多粘菌素均敏感，52 株（93%）对替加环素敏感，4 株（7%）表现为中介敏感，而对其他测试抗生素，如哌拉西林 / 他唑巴坦、头孢哌酮 / 舒巴坦等，耐药率均为 100%。
2. 分子分型结果：PFGE 分析成功对 53 株菌株产生条带图谱，将其分为 10 种 PFGE 类型，其中 G 型菌株最多，有 40 株，主要集中在 ICU3，暗示可能存在克隆爆发。MLST 分型表明，依据牛津分型法，菌株主要为 ST208（41 株，73%），还有其他多种序列类型。平均核苷酸同一性分析显示，所有 56 株 XDRAB 菌株的基因组相似度超过 99.8%。
3. 耐药基因与毒力基因分析：通过对耐药基因的筛查发现，所有菌株都携带 β - 内酰胺酶相关基因，如 bla_{OXA - 23}、bla_{OXA - 66}和 bla_{ADC - 25}，这解释了对碳青霉烯类抗生素的高耐药性。此外，还存在多种氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类等耐药基因，以及多种外排泵基因，这些基因共同作用导致了 XDRAB 对多种抗生素的广泛耐药。毒力基因分析表明，所有菌株都含有多种毒力相关基因，其中 KatA 基因有助于细菌抵御氧化应激，KL7 型荚膜多糖最为常见。
4. 移动元件分析：移动元件分析未发现整合子，但鉴定出多种插入序列，如 ISAba1、ISAba26 等，还检测到两种非结合性质粒 ABkp1 和 pAB0057。
5. ST208 的地理传播：对 ST208 菌株的地理传播分析发现，该菌株已在全球五大洲传播，美国和中国的报告发病率较高，可能起源于北美。中国杭州的检测率最高，且本研究中的 XDRAB - ST208 菌株与来自巴基斯坦的菌株 Pakistan11592 亲缘关系最近。

四、讨论：研究成果的启示与防控建议

本研究中 XDRAB 菌株来源广泛，样本涵盖多种临床标本，这表明其可能在不同感染部位传播，且传播受患者健康状况、医院环境和医疗操作等因素影响。其广泛的耐药性，尤其是对除多粘菌素和替加环素外的所有抗生素耐药，给临床治疗带来极大挑战，可能导致治疗失败和患者预后恶化。

PFGE 作为医院感染爆发调查的金标准，在本研究中发挥了重要作用，它通过分析 DNA 片段的差异，揭示了菌株间的遗传关系，确定了 G 型菌株在 ICU3 的克隆爆发及可能的传播路径。然而，PFGE 也存在局限性，如受菌株自然进化影响，在长期研究中效果受限，且操作繁琐、耗时，不同实验室间可比性差。MLST 则具有标准化和广泛适用性的优势，但分辨率相对较低。本研究中 PFGE 和 MLST 结果存在一定差异，这提示在研究细菌遗传特征和传播动态时，需要综合运用多种分型方法。

WGS 技术的应用为研究提供了更全面的视角，它揭示了菌株间高度的基因组相似性，确定了主要的序列类型和克隆复合体。通过对耐药基因和毒力基因的分析，深入了解了 XDRAB 的耐药机制和致病能力。例如，bla_{OXA - 23}基因在碳青霉烯类抗生素耐药中起关键作用，其表达受插入序列影响，且可通过复合转座子进行水平转移。

此外，研究还发现 XDRAB 菌株携带多种毒力基因，这些基因有助于细菌在宿主体内生存和逃避宿主免疫防御。KL7 型荚膜多糖在本研究菌株中占比较高，与中国的流行情况相符。

ST208 菌株在全球的广泛传播值得关注，其起源于北美，在中国杭州的高检测率可能与当地的医疗环境因素有关。本研究中 XDRAB - ST208 菌株与巴基斯坦菌株的亲缘关系，反映了全球化背景下跨国传播和患者流动对细菌传播的影响。

在研究方法上，虽然短读长测序技术（如 Illumina 测序）能够进行高通量、相对低成本的基因组分析，但在解析复杂基因组结构（如质粒和移动遗传元件）方面存在不足。未来研究可结合长读长测序技术（如 PacBio 或 Oxford Nanopore），更全面地了解 XDRAB 的遗传背景、质粒在耐药传播中的作用以及移动元件的动态变化。

为有效控制医院内 XDRAB 的传播，应加强病原体监测，严格执行感染控制措施，如加强手卫生、做好患者隔离等。同时，规范抗菌药物的使用，避免滥用导致耐药性进一步加剧。对于携带耐药菌株的患者，要加强监测并做好感染控制记录，以便优化未来的预防策略。