亚抑菌浓度抗生素对金黄色葡萄球菌感染影响的关键发现：突变与持留的权衡

《Microbiology Spectrum 3.7》：The tradeoffs between persistence and mutation rates at sub-inhibitory antibiotic concentrations in Staphylococcus aureus

本文研究发现，亚抑菌浓度抗生素会改变金黄色葡萄球菌生长动力学，影响突变率和持留水平，揭示重要权衡关系。

　　

引言

在抗生素治疗的合理设计中，药物的给药浓度通常要超过抑制目标病原体复制所需的阈值。然而在实际治疗过程中，人体内抗生素浓度受血管分布差异、药物代谢动力学（PK）等因素影响，在不同解剖区域存在差异。即便给药浓度超过最低抑菌浓度（MIC），但体内仍会出现亚抑菌浓度的情况。以往研究多聚焦于超抑菌浓度的抗生素药效，忽视了亚抑菌浓度抗生素对细菌群体的影响。

本研究选用临床相关的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）实验室菌株，探究六种不同类别抗生素的亚抑菌浓度对细菌生长动力学、突变率以及持留水平的影响。持留（persistence）是指部分静止期细菌细胞在超抑菌浓度抗生素处理下存活的表型变化。研究旨在明确多种类抗生素亚抑菌浓度预暴露，对细菌后续暴露于不同药物超抑菌浓度时突变率和持留水平的影响，以验证这种影响的普遍性。此前对大肠杆菌的研究发现，亚抑菌浓度抗生素会降低细菌生长速率、最大细菌密度，并延长迟缓期，本研究也将对这些发现的普遍性进行验证。

结果

亚抑菌浓度抗生素对细菌生长动力学的普遍性影响

为研究亚抑菌浓度抗生素对细菌生长动力学的影响，研究人员监测了金黄色葡萄球菌 Newman 菌株在暴露于六种不同类别抗生素亚抑菌浓度时的光密度（OD）变化。结果显示，不同抗生素处理下，金黄色葡萄球菌 Newman 菌株的生长动力学存在差异，且最大生长速率、最大光密度和迟缓时间均呈现出明显的浓度依赖性变化。这一结果与之前对大肠杆菌的研究一致，表明该现象并非革兰氏阴性菌所特有。

亚抑菌浓度抗生素对突变率的影响

为探究突变率估计中的内在差异，研究人员运用了基于蒙特卡罗过程生成突变体的数学和计算机模拟模型。多次独立运行该模型的结果显示，虽然各次运行估计的突变率存在一定差异，但这种差异并无统计学意义。

在研究亚抑菌药物预暴露对金黄色葡萄球菌对抗生素耐药性突变率的影响时，研究人员先让金黄色葡萄球菌 Newman 菌株暴露于六种药物中不改变最大稳定期密度的浓度下 24 小时，随后通过卢里亚 - 德尔布吕克波动试验（Luria - Delbruck fluctuation test）测定其对链霉素耐药性的突变率。结果发现，亚抑菌浓度抗生素预暴露显著提高了对链霉素耐药性的突变率，这一结果是零模型未预测到的。

研究人员进一步探究细菌普遍应激反应（SOS 反应）对突变率增加的作用机制，使用了缺乏 recA 基因（SOS 反应的主要组成部分）的菌株重复上述实验。结果发现，该敲除菌株在预暴露于相同药物浓度时，突变率并无显著增加。不过，JE2 菌株（金黄色葡萄球菌的一种）在预暴露于亚抑菌浓度抗生素后，对链霉素的突变率仍有 10 倍的增加。在实验中，由于选择的抗生素耐药机制为单点突变，限制了可用于测试的药物种类，且氟喹诺酮类药物的基线突变率过低，低于检测限。此外，还发现金黄色葡萄球菌 Newman 菌株对萘啶酸具有异质性耐药性，而对环丙沙星则无此现象。

亚抑菌浓度抗生素对持留水平的影响

为确定持留细胞生成速率对最终持留水平的影响，研究人员构建了具有不同持留细胞生成速率的持留数学和计算机模拟模型。结果表明，较高的持留细胞生成速率会在 6 小时时导致更高的持留水平，在时间 - 杀菌实验中，存活细胞总数会以速率依赖的方式增加。

在研究亚抑菌药物预暴露对持留水平的影响时，研究人员先筛选出金黄色葡萄球菌 Newman 菌株对其表现出持留现象的药物（达托霉素和妥布霉素），并选择合适浓度进行后续时间 - 杀菌实验。为确保药物暴露后的存活细胞是真正的持留细胞，研究人员对最后时间点的单个菌落进行筛选并重复时间 - 杀菌实验，同时测定存活细胞的 MIC，结果均证实存活细胞为持留细胞。实验结果显示，六种抗生素的亚抑菌浓度预暴露均降低了对妥布霉素和达托霉素的持留水平。

由于持留细胞进入休眠状态时代谢活性降低，研究人员通过发光测定法测量细胞内 ATP 含量，评估亚抑菌浓度抗生素预暴露对细菌代谢活性的影响。结果发现，预暴露于选定抗生素的亚抑菌浓度会增加 ATP 水平，表明代谢速率提高，这可能是导致持留水平降低的原因。

讨论

在临床治疗中，抗生素通常以超过抑制病原体复制所需最低浓度的剂量开具处方，MIC 是设计抗生素治疗方案的主要甚至唯一药效学参数。然而，体内多种因素存在显著差异，如感染部位的局部细菌浓度、细菌复制速率、营养物质可用性和免疫反应等，且抗生素在体内并非都能达到超抑菌浓度，治疗过程中体内会形成抗生素浓度梯度，其中包含不足以杀死或抑制细菌复制的亚抑菌浓度。

以往研究发现，亚抑菌浓度抗生素会影响大肠杆菌的生长动力学，本研究证实该现象在金黄色葡萄球菌中同样存在。所有测试的六类药物均呈现出浓度依赖性反应，随着抗生素浓度增加，对细菌生长动力学的损害程度也增加。这表明亚抑菌浓度的抗生素具有显著抗菌活性，在某些情况下，即使浓度远低于 MIC 也可能具有临床效用，这也解释了为何在无法达到超抑菌浓度的感染部位，感染仍能得到成功治疗。此外，亚抑菌浓度抗生素还可能因给药剂量不足、给药间隔延长或药物储存不当导致部分失活等情况而出现。

除了影响生长动力学，亚抑菌浓度抗生素暴露还可能引发细菌的生理变化。细菌暴露于超抑菌浓度抗生素时，耐药突变体可在选择压力下存活并复制。突变率并非固定不变，SOS 反应是调节突变率的重要途径之一，它在细菌 DNA 修复和应对生理应激时发挥关键作用。本研究结果表明，暴露于亚抑菌浓度抗生素是激活 SOS 反应的因素之一。在金黄色葡萄球菌中，SOS 反应主要涉及 LexA 依赖途径和 RexAB 依赖途径，这两条途径的激活会使突变率至少提高一个数量级。当 recA 基因敲除时，这些途径无法激活，亚抑菌浓度抗生素预暴露也不会导致突变率改变。虽然本研究中由于预暴露培养可能存在部分细菌死亡，导致实际突变率可能被低估，但药物预暴露导致突变率增加的趋势依然成立。

亚抑菌浓度抗生素预暴露还会影响细菌的持留水平。持留是一种暂时的表型变化，大部分细菌群体对抗生素敏感，少数群体能在不增加 MIC 的情况下存活。持留细胞可通过进入休眠或缓慢生长状态在抗生素治疗中存活，多种环境因素可改变细菌群体中持留细胞的生成频率，本研究发现亚抑菌浓度的六种不同抗生素暴露是其中一个因素。细菌在遇到其他药物的超抑菌浓度之前，先接触亚抑菌浓度抗生素会引发代谢变化，降低持留细胞的生成速率。研究还发现，亚抑菌浓度抗生素暴露会使细胞内 ATP 浓度升高，表明代谢活性增强，这与持留细胞的休眠状态相悖，从而导致后续暴露于其他药物超抑菌浓度时持留细胞形成速率降低。短期（迟缓期持续时间）暴露于亚抑菌浓度抗生素也会降低持留水平。

这些研究结果不仅有助于深入理解细菌突变、持留与抗生素之间的相互作用，还具有重要的临床意义。在一线抗生素治疗时，体内会形成抗生素浓度梯度。若一线治疗失败并进行二线治疗，不同身体部位的亚抑菌浓度抗生素引发的突变率增加可能导致耐药突变体产生，进而导致治疗失败。另一方面，亚抑菌浓度抗生素预暴露会降低细菌的持留水平，而持留能力是细菌在不利生存条件下的重要属性。因此，降低持留水平有助于增强二线治疗效果，提高超抑菌浓度抗生素在治疗中的有效性，降低复发性感染的风险，这在慢性和复发性感染（如生物膜相关感染）中尤为重要。总体而言，这些发现揭示了一个在临床实践中有实际影响的重要权衡，即亚抑菌浓度抗生素暴露导致的较高突变率和较低持留水平之间的权衡。

材料和方法

生长培养基

所有实验均使用购自 Millipore 的 Muller Hinton II（MH II）肉汤进行。细菌定量在购自 BD 的 Lysogeny Broth（LB）琼脂平板上完成。E 试验在由 MH 肉汤（添加 1.6% 琼脂，购自 HiMedia）制成的 MH 琼脂平板上进行。

生长条件

除非另有说明，所有实验均在 37°C、振荡条件下进行。

细菌菌株

所有实验均使用从 Emory 大学的 Bill Schafer 处获得的金黄色葡萄球菌 Newman 菌株。JE2 ?recA 和 JE2 菌株（来自内布拉斯加转座子突变文库）从 Emory 大学的 Joanna Goldberg 处获得，它们是 MRSA USA300 菌株的衍生物。

抗生素

链霉素（S6501）、磺胺甲恶唑（S6377）、万古霉素（V1130）、头孢曲松（C5793）、磷霉素（P5396）、达托霉素（D2446）均购自 Sigma - Aldrich。妥布霉素（T1598）购自 Spectrum。阿奇霉素（3771）购自 TOCRIS。环丙沙星（A4556）购自 AppliChem Panreac。庆大霉素（BP918 - 1）和利福平（BP2679 - 1）购自 Fisher。萘啶酸（KCN23100）购自 PR1MA。四环素（T17000）购自 Research Products International。所有 E 试验条均购自 Biomérieux。

采样细菌密度

通过在 0.85% 生理盐水中进行系列稀释来估计细菌密度，并在含 1.6% 琼脂的 LB 平板上估计细菌总密度。

生长速率估计

在 Bioscreen C 中通过 OD600 的变化来估计指数生长速率。将 24 小时过夜培养物在 MHII 中稀释至初始密度约为 10⁵个细胞 /mL，每种条件设置五个技术重复，在 100 孔板中进行培养。平板在 37°C 下持续振荡培养，每 5 分钟测量一次 OD600。进行归一化处理后，使用在线可访问的 R Bioscreen C 分析工具（https://josheclf.shinyapps.io/bioscreen_app）计算最大生长速率、迟缓时间和最大 OD 的平均值和标准差。

CFU 与 OD 的相关性

将 10 份含有 10⁵ CFU/mL 金黄色葡萄球菌 Newman 菌株的过夜培养物，分别暴露于亚抑菌或抑菌浓度的抗生素（利福平、万古霉素、磷霉素、头孢曲松、庆大霉素、阿奇霉素）中，浓度分别为 1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.016、0.008、0.004 和 0×MIC。培养 24 小时后，将培养物进行 CFU 平板计数，并使用分光光度计在 600nm 处测量光密度。

肉汤微量稀释法估计最低抑菌浓度

根据临床和实验室标准协会指南测定 MIC，仅在培养基选择上有所不同。在 96 孔板中制备含有两倍系列稀释抗生素的 MHII 培养基，并接种 10⁵个细菌 /mL。通过组合三组不同起始抗生素浓度的两倍系列稀释液来创建扩展梯度。平板在 37°C 振荡条件下培养 24 小时后，测量光密度（OD600）。

波动试验

将金黄色葡萄球菌 Newman、JE2 ?recA 和 JE2 的独立过夜培养物，分别暴露于亚抑菌浓度的抗生素（0.5× 利福平 MIC、0.5× 万古霉素 MIC、0.25× 磷霉素 MIC、0.25× 头孢曲松 MIC、0.25× 庆大霉素 MIC 或 0.25× 阿奇霉素 MIC）或不添加抗生素的培养基中培养。过夜培养物在含有 10⁵ CFU/mL 对数期细胞的 2mL MHII 中制备，然后在选定药物的亚抑菌浓度压力下培养过夜。取 1mL 液体培养物涂布在含有 5× 链霉素 MIC 的 LB 平板上，估计培养物的初始密度。48 小时后计数所有菌落，按照参考文献使用 BZrates（http://www.lcqb.upmc.fr/bzrates）计算突变率，实验设置 20 个生物学重复。

时间 - 杀菌实验

将含有 10⁷个金黄色葡萄球菌 Newman 菌株的培养物，分别在上述亚抑菌浓度的利福平、万古霉素、磷霉素、头孢曲松、阿奇霉素或庆大霉素中过夜或培养 5 小时，对照组在无抗生素条件下培养。培养期结束后，所有培养物在新鲜 MHII 中稀释至 10⁷个细胞 /mL，然后暴露于超 MIC 浓度的链霉素、达托霉素、四环素、妥布霉素或环丙沙星中，在 0、2、4 和 6 小时时估计活菌密度。

群体分析谱试验

按照参考文献进行群体分析谱试验。在 LB 平板中添加萘啶酸或环丙沙星浓度梯度（0、0.5、1、2、4、8、16 和 32×MIC），将金黄色葡萄球菌 Newman 菌株进行多个稀释度（10⁰ - 10^-7）后涂布在每个浓度平板上。48 小时后计数菌落，记录出现菌落的最高稀释度。通过将每个浓度下的最高细胞密度除以无抗生素平板上的存活细胞数，计算存活细胞的频率。

数值解（模拟）

对于补充文本中详细描述的数学模型的数值分析，使用 Berkeley Madonna 软件，并采用针对金黄色葡萄球菌 Newman 菌株估计的参数范围。用于这些模拟的 Berkeley Madonna 程序副本可在https://www.eclf.net获取。

统计分析

使用 GraphPad Prism（10.2.0 版本），对时间 - 杀菌实验进行单因素方差分析，对 ATP 测定进行配对 t 检验，以评估统计显著性。

ATP 测定

使用购自 ThermoFisher Scientific（A22066）的 ATP 测定试剂盒。在进行 ATP 测定时，按照制造商提供的方案进行操作，但有以下改动：将预暴露或未暴露于抗生素的过夜培养物离心收集菌体，用生理盐水洗涤。每个实验设置两个生物学重复，每个重复包含六个技术重复。将培养物重悬于生理盐水中，使用 Branson 针式探头超声仪进行超声处理。超声处理后离心，将上清液转移至黑色 96 孔板中，在室温下孵育 30 分钟，然后在 560nm 处读取发光值。

致谢

本研究得到了美国国立综合医学科学研究所（通过 R35 GM 136407 资助）和美国国立过敏与传染病研究所（通过 U19 AI 158080 资助）的支持。F.B. 感谢西班牙卡洛斯三世卫生研究所 CIBERESP（CB06/02/0053）的支持。资助机构在本研究的设计、执行、数据分析、结果解释以及报告撰写过程中均未发挥任何作用。文章内容仅代表作者个人观点，不一定代表美国国立卫生研究院或西班牙卡洛斯三世卫生研究所的官方观点。