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本研究构建了针对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗生素评估系统，为开发新型抗生素提供了有力工具。
在当今全球细菌感染问题日益严峻的背景下，抗生素耐药性已成为一个慢性大流行病问题。2016年，被忽视疾病药物研发倡议（Drugs for Neglected Diseases initiative）和世界卫生组织（WHO）建立了全球抗生素研究与开发合作伙伴关系，旨在加速开发用于治疗多重耐药细菌感染的新抗生素。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为引起感染的常见致病菌之一，其多重耐药菌株的出现给治疗带来了巨大挑战。本研究针对这一问题，构建了一个针对铜绿假单胞菌的抗生素评估系统，为开发新型抗生素提供了有力工具。
本研究利用两株完全敏感的铜绿假单胞菌菌株KPA888和ATCC 27853，通过同框缺失、定点突变和质粒转化等技术手段，构建了具有不同耐药机制的基因工程菌株。这些菌株涵盖了几乎所有的重要的革兰氏阴性菌耐药机制，为筛选和评估针对特定耐药机制的抗生素提供了有力支持。
在孔蛋白缺失方面，研究发现，铜绿假单胞菌的外膜通透性比大肠杆菌（Escherichia coli）低12-100倍，主要原因是缺乏非特异性孔蛋白，这些孔蛋白有助于小亲水性分子穿过外膜。在本研究中，缺失OprD孔蛋白会导致亚胺培南（imipenem）和美罗培南（meropenem）的最小抑菌浓度（MIC）增加≥4倍，而其他外膜孔蛋白的缺失对所有测试抗生素的MIC影响较小（<2倍）。这一结果与之前的研究一致，表明在40种可识别的孔蛋白中，只有碳青霉烯类抗生素可以通过OprD部分进入细菌。
在研究外排泵对耐药性的影响时，发现铜绿假单胞菌中四个主要的外排泵系统（MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM（或-OprA））的过表达在药物耐药性中起着关键作用。通过删除这些外排泵的调控基因，实现了其过表达，并观察到不同的耐药谱。所有四种外排泵均可导致喹诺酮类和氯霉素的MIC增加≥4倍，而对多粘菌素和磷霉素的MIC影响较小（<2倍）。对于MexAB-OprM外排泵，与亲本菌株相比，ΔmexR、ΔnalC和ΔnalD突变株的β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素和/或复方新诺明的MIC增加了≥4倍。在MexCD-OprJ外排泵中，与亲本菌株相比，ΔnfxB突变株的头孢吡肟、喹诺酮类和/或氯霉素的MIC增加了≥4倍，而四环素类的MIC增加了2-3倍。对于MexEF-OprN外排泵，ΔmexS突变株对亚胺培南和美罗培南的MIC高于亲本菌株，这可能是由于mexS的缺失降低了oprD基因的转录水平，而OprD是有助于碳青霉烯类抗生素摄取的特异性孔蛋白。在MexXY-OprM（或-OprA）外排泵中，与亲本菌株相比，ΔmexZ突变株对头孢吡肟、喹诺酮类、氨基糖苷类和/或氯霉素的MIC增加了至少2倍。
在研究喹诺酮类靶点突变对耐药性的影响时，发现GyrA T83I突变株中，进一步的ParC突变（S87L或S87W）导致所有测试的喹诺酮类药物的MIC增加了≥4倍，而进一步的GyrA突变（D87N）对这些MIC的影响较小（<2倍）。在T83I/S87L或T83I/S87W突变株中，进一步的GyrA突变（D87N）可使这些MIC达到高水平耐药。在所有测试的喹诺酮类药物中，GyrA的单突变T83I或D87N导致MIC增加了≥4倍，而ParC的单突变S87L或S87W对这些MIC的影响较小（<2倍）。这一现象可能解释了为什么在几乎所有的对环丙沙星（ciprofloxacin）耐药的铜绿假单胞菌临床菌株中都能发现GyrA突变（MIC≥2 mg/L），而没有发现单一的parC突变。
在研究质粒介导的耐药机制时，与亲本菌株相比，所有产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的菌株，包括CTX-M-14、CTX-M-15和VEB-3，对氨曲南和头孢吡肟的MIC增加了≥4倍，而两种产AmpC β-内酰胺酶的菌株，包括CMY-2，对哌拉西林和头孢他啶的MIC增加了≥4倍。所有测试的ESBL或AmpC β-内酰胺酶对头孢他啶/阿维巴坦的MIC影响较小（<4倍）。每种测试的碳青霉烯酶，包括KPC-2、NDM-1和VIM-1，导致几乎所有测试抗生素的MIC增加了≥4倍。对于KPC-2菌株，观察到对头孢他啶/阿维巴坦的MIC影响较小（<4倍），因为阿维巴坦可以恢复头孢他啶的活性，通过抑制KPC家族。氨曲南对NDM-1和VIM-1菌株有效，但由于金属β-内酰胺酶产生菌通常共产生其他可以水解氨曲南的β-内酰胺酶，因此建议将氨曲南与其他药物联合使用作为这些感染的潜在治疗方法。
本研究构建的31株具有不同耐药机制的基因工程菌株，为评估抗生素的抗菌活性提供了一个强大的系统。这些菌株具有明确的耐药机制，同时对某些抗生素仍保持敏感。此外，通过非接合性质粒引入质粒介导的耐药性，降低了水平基因转移和随机整合到宿主基因组的风险，使得这些菌株比耐药临床菌株更适合用于评估化合物的抗菌效力。结合之前构建的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）耐药菌株，这些菌株为开发针对革兰氏阴性菌的新抗生素提供了一个全面的评估系统。
