气候对大头树蛙皮肤微生物群落的影响：多样性、功能及适应性研究

《Microbiology Spectrum 3.7》：Microbiome and climate: skin microbial diversity and community functions of Polypedates megacephalus (Anura: Rhacophoridae) associated with bioclimate

本文通过研究发现气候显著影响大头树蛙（Polypedates megacephalus）皮肤微生物群落的多样性、组成和功能。

　　

引言

在生命科学领域，微生物群落与宿主健康的关系一直是研究热点。宿主皮肤微生物组对宿主的健康状况起着至关重要的作用，它通过改变自身的群落组成和功能，深刻影响着宿主的适应度。许多研究已经表明，微生物组多样性的变化，或者优势细菌群落的改变，都会对人类、野生动物以及家养动物的健康产生负面影响。皮肤微生物群的特征受到生物因素（如宿主相关特征）和非生物因素（如温度、水质）的共同塑造，其中气候相关参数在理解宿主相关微生物组的生态学和进化过程中，是一个极为关键的要素。

两栖动物在水生和陆生生态系统中都占据着关键地位，它们的生存状况甚至会影响到人类健康。两栖动物的皮肤不仅承担着呼吸、体温调节、渗透压调节、色素沉着等重要生理功能，还能保护它们免受捕食者和病原体的侵害。然而，这种暴露在外的皮肤对环境变化极为敏感。皮肤微生物群落的组成和相互作用在传染病的发生发展过程中发挥着重要作用，例如蛙壶菌病，这是一种对两栖动物极具破坏性的皮肤疾病。

虽然已有一些研究探讨了生物气候与两栖动物皮肤微生物群落之间的关系，但目前的研究结果并不一致。不同的研究基于不同的测量尺度（如生物地理梯度、宿主物种差异），对生态因素如何影响皮肤细菌多样性的结构和组成给出了不同的解释。同时，在气候条件影响下，两栖动物皮肤微生物群落的功能属性以及群落组成与功能之间的关系，仍缺乏深入研究。

大头树蛙（Polypedates megacephalus）广泛分布于中国南方和东南亚地区，占据着广泛的生态位。鉴于其广泛的地理分布范围以及气候对动物微生物组的重要影响，研究人员提出假设：大头树蛙的皮肤微生物群与气候因素密切相关。为了验证这一假设，研究人员在中国广西沿纬度梯度选取了不同地点的大头树蛙种群，采集皮肤微生物样本，这些地点具有不同的环境条件。研究人员预测，微生物群落的多样性和组成会受到气候相关因素的强烈影响，微生物群落功能属性的多样性和组成与气候特征之间会呈现出相关性（正相关或负相关），并且微生物群落的功能属性和分类多样性对气候变异的响应相似，这反映了气候波动对微生物功能冗余的影响。

研究方法

1. 野外样本采集：2021 年，研究人员在中国广西地区的 9 个野外地点，采集了大头树蛙成年个体的皮肤拭子样本。这些地点包括安江平（n = 2）、铜江（n = 4）、碧云湖（n = 1）、天平（n = 6）、大瑶山（n = 1）、东中（n = 4）、五指山（n = 3）、那宽（N = 3）、平龙（N = 7）。采集时使用无菌拭子获取表皮拭子，采集完成后将树蛙放归捕获地点。在样本采集和分析过程中，严格遵循标准化协议和生物安全措施，以防止个体间的交叉污染和病原体在不同栖息地之间的传播。
2. 生物气候变量：从 CHELSA v.1.2 数据库下载了 19 个生物气候变量，分辨率为 30 弧秒。为了降低气候因素的维度，对这些变量进行主成分分析，第一主成分得分代表温度和降水相关因素。
3. DNA 提取和 16S rRNA 基因测序：使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 从拭子中提取 DNA，然后通过 PCR 扩增基因组 DNA。利用特定引物（515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 和 806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增 16S rRNA 基因的 V4 区域，并添加条形码。每个 PCR 反应体系包含 15 μL 的 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs）、0.2 μM 的正向和反向引物以及 10 ng DNA 提取物。PCR 扩增条件为：98°C 初始变性 1 分钟，然后进行 30 个循环，每个循环包括 98°C 变性 10 秒、50°C 退火 30 秒、72°C 延伸 30 秒，最后 72°C 延伸 5 分钟。PCR 产物通过磁珠纯化，生成测序文库并添加索引。使用 Qubit v.2.0 Fluorometer（Life Technologies, California, USA）和 Agilent 2100 Bioanalyzer system（Agilent Technologies, California, USA）评估文库质量。将定量后的文库混合，在 Illumina 平台上进行测序，生成 250 bp 的双端测序 reads。
4. 生物信息学分析：利用 Python v.3.6.13 处理双端测序 reads，通过 cutadapt v.3.3 去除接头序列。使用 FLASH v.1.2.11 将双端 reads 进行合并，利用 fastp v.0.23.1 对原始标签进行质量过滤，借助 vsearch 软件包去除嵌合体序列。

通过 Uparse v.7.0 对序列进行分析，将相似度≥97% 的序列归为同一个微生物操作分类单元（OTU）。基于 Mothur 算法，使用 silva 数据库对每个 OTU 的代表性序列进行分类信息注释。根据样本中序列数最少的样本，将 OTU 丰度稀疏化至每个样本 13,573 条序列。运用 MUSCLE v.3.8.31 对多个序列进行比对，分析不同 OTU 之间的系统发育关系。将在至少 90% 的蛙样本中都存在的 OTU 定义为核心皮肤微生物群。

采用通过重建未观察状态对群落进行系统发育研究（PICRUSt）的方法，基于 16S rRNA 基因序列预测微生物群落的京都基因与基因组百科全书（KEGG）直系同源（KO）功能谱。同时，使用 Tax4Fun2 将 16S rRNA 基因序列与构建的参考数据库进行比对，根据物种比例及其系统发育关系计算特定功能的功能冗余指数（FRI）。FRI 值越高，代表功能稳定性越高；FRI 值越低，则意味着微生物群落发生变化和受到干扰后，功能丧失的可能性越大。5. 统计分析：运用基于 Bray-Curtis 距离的算术平均非加权配对法（unweighted pair group with arithmetic mean method），测量不同地点微生物组的总体群落结构和聚类模式。为了探究气候相关因素对大头树蛙微生物组的分类和群落功能多样性及组成是否有显著影响，首先计算三个 α - 多样性指标：香农多样性指数（Shannon diversity index）、OTU 丰富度（OTU richness）和费思系统发育多样性（Faith’s PD）。其次，使用 vegan 软件包中的 adonis2 函数，通过 9,999 次随机置换计算微生物 β - 多样性和功能的加权 Bray-Curtis 距离和非加权贾卡德距离（unweighted Jacarrd distances）。利用主坐标分析（Principal coordinate analyses）可视化青蛙样本中皮肤微生物群落和功能差异之间的距离相关性。然后，通过 Mantel 检验和线性回归分析，研究青蛙样本中皮肤微生物 α - 多样性指标、β - 多样性以及群落功能属性与生物气候变量之间的关系。运用 vegan 软件包中的 Spearman 相关性分析，在属水平上分析微生物群落组成随气候因素的变化，评估气候因素与微生物分类群之间的显著关联。确定 KEGG 通路（第 3 级 KO）中与气候因素相关的特定功能类别。为了验证皮肤微生物群落组成和群落功能属性对气候变化的响应是否相似，分析微生物群落多样性和群落功能属性之间的关系。最后，分析皮肤微生物组 FRI 与气候因素的关系，解释气候变异性对微生物群落功能冗余的影响。

研究结果

1. 微生物群落组成：大头树蛙皮肤细菌的 OTU 分类组成中，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetota）和厚壁菌门（Firmicutes）占主导地位，相对丰度分别为 69.76%、6.89%、5.33%、3.68%、2.84% 和 2.47%。微生物组的层次聚类分析表明，大头树蛙皮肤具有位点特异性的微生物群落结构。

研究共鉴定出 56 个 OTU 作为核心细菌群落，这些核心群落主导了大多数青蛙的皮肤菌群，平均相对丰度为 46%（最低 8%，最高 96%）。大多数核心 OTU 属于假单胞菌属（Pseudomonas），占每只青蛙平均相对丰度的 10.20%。有一个个体的核心群落丰度最低（3%），其皮肤菌群主要由巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae）成员主导。2. 微生物多样性与气候因素的关系：皮肤微生物 α - 多样性指数与气候因素存在显著关系（Mantel 检验：皮尔逊相关系数r = 0.162，P = 0.024）。在较寒冷或干燥的气候条件下，青蛙皮肤微生物的丰富度和系统发育多样性增加。例如，皮肤微生物群的 α - 多样性随最冷月份的最低温度（bio6）降低而降低（丰富度：R² = 0.526，P < 0.0001；香农指数：R² = 0.469，P <0.0001；系统发育多样性 [PD]：R² = 0.319，P = 0.001）。

微生物 β - 多样性与温度因素（PC1；F = 3.17，R² = 0.10，P < 0.0001）和降水因素（PC2；F = 2.01，R² = 0.06，P = 0.006）均有显著关联，这与 Mantel 检验结果一致（皮尔逊相关系数r = 0.234，P = 0.001）。研究发现，拜叶林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、黄色杆菌科（Xanthobacteraceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、异常球菌科（Deinococcaceae）、草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）和未分类的叶绿体科成员与温度因素相关，在较寒冷的气候中其相对丰度增加；丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、莫拉克斯氏菌科（Moraxellaceae）、蛭弧菌科（Bdellovibrionaceae）、微小杆菌科（Exiguobacteraceae）、哈夫尼菌科（Hafniaceae）、微杆菌科（Microbacteriaceae）、鞘氨醇杆菌科（Sphingobacteriaceae）和黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）成员与降水因素相关。3. 微生物群落功能与气候因素的关系：大头树蛙皮肤微生物的大多数功能特征与代谢相关（48.65% ± 0.019%）。KEGG 通路（第 2 级 KO）中前五大功能类别包括膜转运（12.81% ± 0.018%）、氨基酸代谢（10.25% ± 0.006%）、碳水化合物代谢（9.75% ± 0.003%）、复制与修复（6.56% ± 0.003%）和能量代谢（5.46% ± 0.005%）。

气候因素显著影响树蛙皮肤微生物组的功能多样性，其变化趋势与 PC1 和 PC2 背景下的微生物多样性变化趋势相似。Mantel 检验表明，皮肤微生物功能组成的变化与生物气候变量显著相关（Spearman 相关系数r = 0.150，P = 0.031）。在置换多元方差分析中，功能差异与温度相关因素（F = 4.789，R² = 0.142，P < 0.006）和降水相关因素（F = 4.029，R² = 0.122，P = 0.021）的关联也呈现出相同的模式。

许多功能项目与气候相关因素呈正相关。例如，ATP 结合盒（ABC）转运蛋白的相对丰度随最冷月份的最低温度（bio6）升高呈增加趋势，随最冷季度的平均月降水量（bio19）增加呈降低趋势。4. 微生物群落多样性与功能的关系：皮肤微生物群落多样性与群落功能多样性呈正相关（香农指数：R² = 0.75，P < 0.001）。微生物群落组成与功能属性之间也存在这种正相关关系（线性回归：R² = 0.41，P < 0.001；Mantel 检验：r = 0.7437，P < 0.001）。此外，功能冗余指数与温度和降水因素显著相关，皮肤微生物组的功能冗余随最冷月份的最低温度增加而增加。

讨论

研究结果表明，大头树蛙的皮肤微生物多样性、群落组成以及群落功能与气候条件的变化密切相关。皮肤微生物组的分类多样性和功能多样性会随着气候波动，尤其是温度变化而增加。微生物群落的功能属性会随着群落多样性和组成的变化而同步改变。功能冗余与气候因素之间的正相关关系表明，与气候变化相关的环境过滤对微生物群落功能冗余产生负面影响，温暖湿润的气候可能导致微生物群落功能冗余值降低。

在大头树蛙皮肤微生物群中，变形菌门的相对丰度最高，这与之前在温带和热带两栖动物种群中的观察结果一致。并且，该门的相对丰度随气候变冷而增加。丰富的变形菌可能有助于几丁质转化为壳聚糖和纤维素。尽管大头树蛙皮肤具有位点特异性的微生物群落结构，但某些位点的微生物群与近端位点的微生物群并没有聚集在一起。例如，东中（DZ）地点的微生物群与大瑶山的更为相似，而与距离较近的平龙和那宽地点的微生物群差异较大。这表明地理距离对微生物群差异的影响较弱，当地栖息地的影响更为显著。

皮肤微生物组的 α - 多样性与气候因素相关，在向寒冷湿润气候转变的过程中，微生物多样性增加。温暖气候下皮肤微生物组多样性较低，可能是因为某些微生物具有较高的最适生长温度，在稳定的热环境中它们的竞争相互作用增强。例如，食酸菌属（Acidovorax）在寒冷气候中的相对丰度降低，这可能导致其他具有相似生态位的分类群因营养或生长条件需求而增加丰度。此外，某些微生物对湿润气候的依赖性更强，如丛毛单胞菌科和莫拉克斯氏菌科的成员与降水因素高度相关，这些科在巴拿马两栖动物中较为丰富。相反，大头树蛙在寒冷气候下较高的微生物多样性可能表明宿主已经进化出更复杂的适应性免疫。

对于皮肤微生物群落的 β - 多样性，研究结果显示温度相关参数对皮肤微生物群落差异的驱动作用比降水相关参数更强。一种可能的解释是，温度可能强烈影响某些微生物的定植，从而导致微生物群落结构和组成的变化。尽管存在位点气候差异，但研究确定了大头树蛙的一些核心分类群，尤其是假单胞菌属成员，它们可能对宿主具有重要功能，如抵抗病原体。这表明某些皮肤微生物群在面对各种气候条件时，倾向于表现出有效的响应，以帮助宿主在更广泛的地理区域生存。

先前的研究表明，微生物的代谢过程会受到温度和降水自然波动的强烈影响。在气候影响下，代谢特征的变化为理解微生物群落结构和组成的变化机制，以及宿主应对气候变化的方式提供了线索。例如，ABC 转运蛋白的相对丰度随最冷月份温度升高而增加，随最冷季度降水量增加而减少。这与考齐蛙（Eleutherodactylus coqui）微生物组代谢活动的研究结果相似，在凉爽干燥季节，ABC 转运蛋白的代谢活动增强。这是因为较冷的气候会抑制宿主免疫，使得 ABC 转运蛋白的关键功能（包括营养物质输入和分子输出）增强。

微生物群落的功能特征与寒冷气候呈正相关，分布更为广泛，这与气候波动下微生物分类多样性的变化相似。并且，微生物群落功能属性会随着群落组成同步变化。在较冷气候下，皮肤微生物群的功能冗余较高，这表明大头树蛙可以选择更多耐寒微生物来增加功能冗余，从而促进皮肤微生物组群落功能的稳定性。皮肤微生物群落组成和功能特征的分布对于两栖动物应对气候变化至关重要。因此，需要进一步扩大大头树蛙和其他两栖动物物种的采样地点，以加深对群落功能与分类多样性以及气候变化之间关系的理解。

气候变化，如温度升高和降雨增加，会显著影响微生物的多样性和功能。大头树蛙微生物群落组成和功能随温度和降水变化的模式表明，气候变化将降低宿主皮肤微生物组的多样性和功能稳定性。重要的是，微生物组结构的改变可能会影响宿主的免疫力和生存<