Geotalea daltonii FRC-32 中苯甲酸在乙酸存在下的差异厌氧氧化机制及环境修复意义

《Microbiology Spectrum》：Differential anaerobic oxidation of benzoate in Geotalea daltonii FRC-32

本文聚焦Geotalea daltonii FRC-32，研究其在乙酸存在时对苯甲酸的厌氧氧化机制。发现该菌能根据碳源浓度差异，进行同步或顺序碳源氧化，揭示苯甲酸转运及关键基因调控机制，为芳香污染物生物修复提供理论依据。

　　

引言

芳香化合物污染环境的修复是紧迫问题，生物修复在厌氧地下环境中尤为重要。苯甲酸常被用作研究细菌芳香化合物分解代谢的模型化合物，其降解起始于激活为苯甲酰辅酶 A，该物质是多数芳香化合物代谢的关键中间产物。此前研究表明，苯甲酰辅酶 A 途径在G. daltonii FRC-32 对多种芳香化合物的厌氧代谢中起核心作用。

乙酸作为两碳分子，易转化为乙酰辅酶 A 进入柠檬酸循环，能高效产生 ATP。而苯甲酸激活和转化为与中心代谢途径兼容的中间产物需多步酶促反应，耗能更高。因此推测，相较于苯甲酸，乙酸为G. daltonii FRC-32 的细胞代谢提供了更直接高效的途径。

微生物在多碳源环境中，常优先利用能量有利的碳源，碳代谢物阻遏（CCR）可下调能量不利碳源的降解途径，促进顺序碳源利用，导致二次生长。但 CCR 可能降低微生物修复芳香污染环境的能力，能同时氧化多种碳源的微生物是修复的理想候选者。本研究旨在阐明G. daltonii FRC-32 在乙酸存在下厌氧氧化苯甲酸的潜在机制，包括苯甲酸氧化机制、苯甲酰辅酶 A 途径相关基因的调控以及苯甲酸的转运。

材料与方法

• 培养条件：在严格厌氧条件下培养G. daltonii FRC-32，使用苯甲酸、乙酸、甲苯、苯等作为电子供体，富马酸作为电子受体。设置多种碳源组合，如 1 mM 苯甲酸 + 2 mM 乙酸、1 mM 苯甲酸 + 5 mM 乙酸等，让菌株适应不同碳源组合生长，研究苯甲酸氧化机制。
• 底物和代谢物分析：从培养物中厌氧提取液体培养基样品，过滤后用离子色谱仪测定乙酸和苯甲酸浓度。
• 苯甲酸在全细胞裂解物中的积累分析：制备全细胞裂解物，通过离子色谱分析细胞内苯甲酸是否积累。
• 总细胞蛋白分析：收获细胞，裂解后进行 SDS-PAGE 电泳，染色和脱色后分析总细胞蛋白。
• 总 RNA 提取：对G. daltonii FRC-32 培养物提取总 RNA，去除 DNA 后测定浓度和纯度。
• 引物设计：根据G. daltonii FRC-32 全基因组序列设计引物，合成后进行检测。
• 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）：以总 RNA 为模板进行 cDNA 合成，通过 PCR 扩增验证 cDNA 产物。
• 定量实时逆转录 PCR（qRT-PCR）：以纯化的 RT-PCR 扩增子为校准标准，进行 qRT-PCR 反应，分析基因表达水平。
• 厌氧苯甲酸氧化基因的鉴定：通过 BLAST 比对，在G. daltonii FRC-32 基因组中鉴定出 < bamNOPQ和基因。
• 蛋白质结构和蛋白质 - 配体结合亲和力预测：利用相关工具预测 BenK 的分子量、蛋白质结构和蛋白质 - 配体结合亲和力。
• 统计分析：采用非配对双尾 Student t检验进行统计分析，设定P < 0.05 为有统计学意义。

结果与讨论

• G. daltonii FRC-32 在乙酸存在下对苯甲酸的厌氧氧化：不同碳源组合培养下，G. daltonii FRC-32 的生长和碳源氧化模式不同。在 1 mM 苯甲酸 + 2 mM 乙酸、1 mM 苯甲酸 + 5 mM 乙酸和 2 mM 乙酸加 1 mM 苯甲酸的培养条件下，菌株呈现单峰生长和同步碳源氧化；而在 5 mM 乙酸加 1 mM 苯甲酸的培养条件下，菌株出现双峰生长和顺序碳源氧化。

通过检测细胞内苯甲酸积累发现，在 1 mM 苯甲酸 + 2 mM 乙酸、1 mM 苯甲酸 + 5 mM 乙酸和 2 mM 乙酸加 1 mM 苯甲酸的培养物中，细胞内有苯甲酸积累；但在 5 mM 乙酸加 1 mM 苯甲酸的培养物中未检测到积累。这表明较低浓度乙酸利于苯甲酸的转运和氧化，而高浓度乙酸可能抑制苯甲酸氧化。

当以 1 mM 苯甲酸为碳源，添加 2 mM 乙酸后，菌株生长增强，且两种碳源同步氧化，但苯甲酸未完全氧化。这说明乙酸虽未增强苯甲酸氧化，但也未阻止其氧化，暗示苯甲酸的差异氧化可能受动态环境条件调控。

• 不同苯甲酸和乙酸可用性的预培养条件对苯甲酸氧化的G. daltonii FRC-32 培养物生长特性的影响：用不同预培养条件的接种物培养G. daltonii FRC-32，发现接种物碳源影响菌株在苯甲酸上的生长特性。接种预培养于苯甲酸和乙酸组合的菌株，生长更好；而接种预培养于乙酸加苯甲酸的菌株，生长较差；接种预培养于乙酸的菌株则无法生长。这表明微生物需代谢可塑性来适应碳源变化。
• 苯甲酸在G. daltonii FRC-32 培养物中的转运：基因编码的 BenK 可能是苯甲酸转运蛋白，其基因与苯甲酸降解基因簇相邻。预测 BenK 有 12 个跨膜区域，形成中央转运通道，与其他苯甲酸转运蛋白结构相似。

通过预测蛋白质 - 配体结合亲和力发现，BenK 对苯甲酸、甲苯、苯和乙酸都有一定结合亲和力，但对苯甲酸亲和力最高。同时，在苯甲酸氧化时，基因转录水平显著高于苯和甲苯氧化时，且在添加苯甲酸的培养物中表达上调，在仅以乙酸为碳源的培养物中未检测到 BenK 表达。这些结果表明 BenK 可能在苯甲酸转运中起作用。

• G. daltonii FRC-32 培养物中 < bamNOPQ的调控：在不同碳源培养条件下，检测 < bamNOPQ基因的转录水平。在仅以乙酸为碳源的培养物中，这些基因转录水平较低；在 1 mM 苯甲酸 + 5 mM 乙酸的培养物中，中期对数期转录水平显著升高；在 5 mM 乙酸加 1 mM 苯甲酸的培养物中，第一阶段对数期转录水平较低，滞后阶段和第二阶段中期对数期转录水平升高。这说明碳源可用性差异导致 < bamNOPQ基因表达不同，进而促进苯甲酸的差异氧化。
• 结论：本研究表明，G. daltonii FRC-32 能根据碳源可用性差异，通过同步或顺序碳源氧化方式对苯甲酸进行差异氧化。这种氧化方式并非传统意义上的碳代谢物阻遏（CCR），而是一种适应性调节反应，体现了该菌的代谢可塑性。

研究还发现苯甲酸转运和细胞内积累在苯甲酰辅酶 A 途径相关基因的调控中起作用，细胞内苯甲酸诱导 < bamNOPQ基因差异表达，从而导致苯甲酸在乙酸存在下的差异氧化。本研究首次在Geobacteraceae家族中研究苯甲酸转运，为理解厌氧苯甲酸氧化机制提供了重要依据。