标题：Geotalea daltonii FRC-32在厌氧条件下对苯甲酸氧化的代谢调控机制

《Microbiology Spectrum 3.7》：Differential anaerobic oxidation of benzoate in Geotalea daltonii FRC-32

摘要：本研究深入探讨了Geotalea daltonii FRC-32在厌氧环境中对苯甲酸（benzoate）和乙酸（acetate）的代谢策略，揭示了其在不同碳源条件下的代谢灵活性及其对芳香族化合物降解的潜在机制。

　　内容：

前言

Geotalea daltonii FRC-32是一种在厌氧条件下具有降解芳香族化合物能力的细菌，其在含芳香族化合物污染的缺氧环境中发挥着重要作用。然而，关于其在多种碳源存在时的代谢调控机制尚不清楚。本研究旨在阐明G. daltonii FRC-32在厌氧条件下对苯甲酸氧化的代谢途径，以及其在不同碳源条件下的代谢灵活性。

材料与方法

培养条件

G. daltonii FRC-32在严格厌氧条件下培养，使用苯甲酸（1 mM）、乙酸（2或5 mM）、甲酸（10 mM）作为电子供体，富马酸作为电子受体。通过不同浓度的苯甲酸和乙酸组合培养，研究其代谢策略。

基质和代谢物分析

通过离子色谱法（IC）测定培养液中乙酸和苯甲酸的浓度，分析其氧化情况。

苯甲酸在全细胞裂解液中的积累分析

通过制备全细胞裂解液，分析细胞内苯甲酸的积累情况，以了解苯甲酸的转运机制。

总蛋白分析

通过SDS-PAGE分析G. daltonii FRC-32细胞的总蛋白，检测与苯甲酸转运相关的蛋白表达情况。

总RNA提取与基因表达分析

提取G. daltonii FRC-32的总RNA，通过RT-PCR和qRT-PCR技术分析苯甲酸转运蛋白基因benK及相关代谢途径基因的表达水平。

蛋白结构和配体结合亲和力预测

利用AlphaFold网络预测苯甲酸转运蛋白BenK的蛋白结构，并通过AutoDock/Vina软件预测其与苯甲酸等配体的结合亲和力。

结果与讨论

厌氧条件下苯甲酸的氧化

在不同碳源条件下培养的G. daltonii FRC-32表现出不同的生长和代谢模式。在1 mM苯甲酸 + 2 mM乙酸和2 mM乙酸中加入1 mM苯甲酸的培养条件下，苯甲酸和乙酸被同时氧化，表现出单相生长。而在5 mM乙酸中加入1 mM苯甲酸的培养条件下，出现了双相生长，苯甲酸氧化被延迟至乙酸浓度降至约2.5 mM时才开始。这表明乙酸浓度对苯甲酸的氧化具有显著影响，且G. daltonii FRC-32能够根据碳源可用性调整其代谢策略。

苯甲酸的细胞内积累与转运

在1 mM苯甲酸 + 2 mM乙酸和1 mM苯甲酸 + 5 mM乙酸培养条件下，细胞内检测到苯甲酸的积累，表明苯甲酸能够被运输到细胞内。而在5 mM乙酸中加入1 mM苯甲酸的培养条件下，未检测到细胞内苯甲酸的积累，这可能是因为高浓度的乙酸抑制了苯甲酸的转运。此外，通过基因表达分析发现，苯甲酸转运蛋白基因benK在苯甲酸存在时表达上调，且在苯甲酸和乙酸共存的培养条件下，其表达水平显著高于仅以乙酸为碳源的培养条件。这些结果表明，苯甲酸的细胞内积累可能诱导了苯甲酰辅酶A（benzoyl-CoA）途径相关基因的表达，从而促进了苯甲酸的氧化。

苯甲酸转运蛋白BenK的功能与调控

通过蛋白结构预测和配体结合亲和力预测，发现BenK具有12个跨膜区域，形成一个中央运输通道，其对苯甲酸的结合亲和力最高（-6.5 kcal/mol），对乙酸的结合亲和力最低（-3.6 kcal/mol）。这表明BenK可能具有较高的苯甲酸转运特异性。此外，通过SDS-PAGE分析发现，在苯甲酸、甲苯和苯存在时，细胞内检测到与BenK预测大小（约43 kDa）相符的蛋白条带，而在仅以乙酸为碳源的培养条件下未检测到该蛋白条带。这些结果进一步支持了BenK在苯甲酸转运中的功能，并揭示了其表达可能受到苯甲酸的诱导。

bamNOPQ基因的表达调控

bamNOPQ基因编码的蛋白参与苯甲酸的厌氧氧化过程。在5 mM乙酸 + 1 mM苯甲酸培养条件下，bamNOPQ基因的表达水平在中对数期显著高于仅以乙酸为碳源的培养条件，表明乙酸并未抑制这些基因的表达。而在5 mM乙酸中加入1 mM苯甲酸的培养条件下，bamNOPQ基因的表达在第一对数期受到抑制，但在滞后期和第二对数期表达上调，这与苯甲酸氧化的延迟启动相一致。这些结果表明，bamNOPQ基因的表达受到碳源可用性的调控，且在苯甲酸和乙酸共存时，其表达模式与苯甲酸的氧化模式密切相关。

结论

本研究揭示了G. daltonii FRC-32在厌氧条件下对苯甲酸氧化的代谢调控机制。该菌株能够根据碳源的可用性，通过同时或顺序氧化苯甲酸和乙酸来调节其代谢策略。苯甲酸的细胞内积累和转运蛋白BenK的表达在调控苯甲酸氧化过程中起着关键作用。此外，bamNOPQ基因的表达受到碳源可用性的调控，且与苯甲酸的氧化模式密切相关。这些发现不仅为理解G. daltonii FRC-32在动态环境条件下的代谢灵活性提供了重要的理论依据，也为利用该菌株进行生物修复提供了潜在的应用前景。