肠道微生物新发现：碳水化合物复杂性影响菌群多样性的关键指标

《Microbiology Spectrum 3.7》：Diversity in chemical subunits and linkages: a key molecular determinant of microbial richness, microbiota interactions, and substrate utilization

本文开发了化学亚基和连接（CheSL）香农多样性指标，揭示其与微生物多样性等的关系，为膳食优化提供依据。

　　

引言

肠道微生物群在人体健康中发挥着至关重要的作用，它们参与代谢难以消化的膳食底物、调节免疫系统以及抵御病原体感染等过程。目前，研究人员致力于通过多种方式调控肠道微生物群来改善宿主健康，比如添加新的膳食底物（如益生元和膳食纤维）、引入新的微生物（如益生菌和活微生物疗法）或者采用底物与微生物的组合（如合生元）。

饮食是影响微生物组成的主要因素之一。在小鼠实验中，西式饮食会导致微生物群组成发生显著变化，与富含复杂多糖的低脂、低糖饮食相比，差异明显。在人类中，长期的饮食模式也与微生物群组成存在相关性。其中，膳食纤维因其不能被人体酶代谢，且能被肠道微生物代谢产生如丁酸等可被宿主利用的产物，成为调节肠道微生物群的研究热点。

“营养生态位理论” 为理解饮食对微生物群组成的影响提供了理论框架。该理论指出，微生物群落成员的代谢潜能和营养物质的可利用性决定了生态位的占据情况。增加可利用底物的种类可能会扩大基本生态位空间，促进微生物丰富度的增加，但营养竞争和环境限制也可能限制微生物的定植。

近期研究开始关注碳水化合物结构多样性对微生物群落组成的影响。已有研究表明，更复杂的纤维或纤维混合物能够增加微生物群落的丰富度和多样性，但不同研究之间存在一定差异。例如，不同复杂碳水化合物之间的细微结构差异，可能对微生物丰富度产生显著影响。

在本研究中，研究人员通过体外实验和计算建模相结合的方式，分析了人类粪便微生物群落对碳水化合物多样性和浓度变化的响应。他们开发了一种新的指标 —— 化学亚基和连接（CheSL）香农多样性，用于量化碳水化合物的多样性，并研究其对微生物群落的影响。

结果

1. 量化碳水化合物复杂性的指标开发：为了研究碳水化合物复杂性对培养基中独特生态位的潜在贡献，研究人员开发了 CheSL 指标。该指标基于每种碳水化合物中存在的独特游离单糖和连接的数量来量化碳水化合物的复杂性。在评估碳水化合物复杂性时，考虑内部连接至关重要，因为多糖的复杂性决定了它能提供的独特生态位数量，以及微生物编码降解所需酶的可能性。例如，双歧杆菌（Bifidobacterium longum）和多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）能够完全降解简单纤维淀粉，但却无法完全代谢阿拉伯半乳聚糖这种更复杂的多糖。

CheSL 指标的主要输入包括每种碳水化合物中连接的分数组成以及每种培养基中碳水化合物的分数组成，分别用连接矩阵（L）和培养基矩阵（M）表示。通过一系列计算，可以得到表示培养基中连接排列（或亚基）浓度的矩阵S，进而计算出 CheSL 香农多样性（CSIk?）和 CheSL 香农均匀度（CSEk?）。在该指标中，单体葡萄糖的 CheSL 值被设为 0，因为许多细菌都具备代谢葡萄糖的保守途径，它难以提供独特的生态位。而其他独特的单糖，如阿拉伯糖、N - 乙酰葡糖胺和 d - 葡萄糖醛酸等，其 CheSL 丰富度值被设为 1，因为它们的摄取和利用途径不像葡萄糖那样广泛保守，可能代表独特的生态位。其他多糖的 CheSL 值主要根据其独特连接排列的数量来确定。2. CheSL 香农多样性与微生物丰富度的关联：研究人员假设增加可利用底物的数量会扩大基本生态位空间，促进微生物丰富度的增加。为此，他们从两名健康人类的粪便样本中获取微生物群落，并在连续流动微型生物反应器阵列（MBRAs）中，用不同碳水化合物组成和丰度的培养基进行培养。实验设置了四种培养基（NS、MM、5MM 和 IL），这些培养基在碳水化合物组成和丰度上有所不同，但都含有相同的蛋白质、脂质和微量矿物质基础。通过对 16S rRNA 基因 V4 区域测序，研究人员发现微生物群丰富度（观察到的 ASV 数量）与 CheSL 香农多样性的相关性最强，而非 CheSL 丰富度。具体来说，ASV 丰富度与 CheSL 丰富度的皮尔逊相关系数R=0.64（P=0.0024），与 CheSL 香农均匀度的相关系数为0.21（P=0.38），与 CheSL 香农多样性的相关系数为R=0.74（P=0.00019）。

进一步对 FSA 在更多培养基中的培养实验发现，增加数据后，ASV 丰富度与 CheSL 丰富度（R=0.71，P=4.4×10?6）、CheSL 香农均匀度（R=0.63，P=0.00011）和 CheSL 香农多样性（R=0.8，P=3.5×10?8）的相关性更高。对另外两个已发表数据集的评估也观察到了类似的相关性，但由于底物复杂性和某些多糖近似处理的原因，部分数据的统计显著性有所降低。这表明 CheSL 香农多样性具有广泛的适用性，但在某些粪便群落和碳水化合物结构的应用中可能存在局限性。3. CheSL 香农多样性对肽利用的预测作用：研究人员利用 PICRUSt2 从 16S rRNA 基因序列推断基因组内容，并使用 STAMP 识别不同培养基中培养的群落之间差异丰富的功能途径。以 FSA 在不同培养基中的培养数据为重点，他们发现微生物群落中潜在编码 l - 精氨酸降解（Stickland 发酵）基因的分类群在共享丰富度较高的群落（在 B、GM、AP 和 ILC 中培养）中富集，而在共享丰富度较低的群落（在 AM 和 GP 中培养）中较少。同时，丙酮酸发酵为丁酸的预测途径在这些群落中也有类似的富集情况。

通过商业检测方法测量培养上清液中剩余肽的水平，研究人员发现不同培养基中培养的群落对肽的利用存在差异。并且，肽利用与 CheSL 香农多样性之间存在很强的相关性（R=?0.77，P=9.5×10?6），与微生物群丰富度单独的相关性相似，且高于与 CheSL 香农均匀度的相关性。由此推断，在含有更复杂碳水化合物混合物的培养基中培养的群落，肽利用可能作为一种额外的底物生态位，或者这些群落可能需要更高的肽利用来促进碳水化合物的降解能力。4. 核心微生物在群落中的作用：微生物相互作用对微生物群落的组装、稳定性和功能具有重要影响。研究人员使用 LIMITS 算法，通过拟合离散的 Lotka - Volterra 模型来推断微生物相互作用。由于 LIMITS 算法假设总群落生物量在时间上变化不大，为了提高模型质量，研究人员采用移动窗口方法，将数据划分为多个较短时间周期的子集进行分析。

最初在 ASV 水平上比较同一培养基中培养的重复群落的整体网络时，发现很少有相互作用是保守的。但在属水平上评估时，发现同一培养基内重复样本之间的相互作用是保守的。对 FSA 在多种培养基（B、AP、AM、GP、GM 和 ILC）中培养的整体模型分析发现，网络中节点数量（代表相互作用的分类群）与培养物的共享丰富度之间存在明显趋势。在这些网络中，发现了三个始终处于中心地位的分类群：拟杆菌属（Bacteroides）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和未分类属的瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）。尤其是在 CheSL 香农多样性较高的培养基中，Lachnospiraceae和未分类属的Ruminococcaceae表现出保守的中心性，且这些培养基产生的整体网络更为复杂。此外，支持最高微生物群丰富度的培养基类型中，保守网络的连接性更强。而对于相互作用保守性较低的培养基（如 GP 和 AP），通过差异富集分析发现，与 B 培养基相比，GP 培养基中大多数分类群的丰度下降，除了Clostridium属和Bifidobacterium属；AM 培养基中许多属的丰度下降，但Collinsella属富集。

讨论

本研究开发了基于 CheSL 丰富度、CheSL 香农多样性和 CheSL 香农均匀度的新指标来描述碳水化合物的复杂性。研究发现，具有较高 CheSL 香农多样性的碳水化合物混合物能够支持具有更高丰富度和保守微生物相互作用的人类粪便微生物群落生长，这与最初认为 CheSL 丰富度是微生物丰富度主要驱动因素的假设相反，表明 CheSL 香农均匀度在微生物群落组装中可能发挥重要作用。当碳水化合物混合物的 CheSL 香农多样性较低且均匀度较高时，不同碳水化合物生态位的物种竞争可能导致其他物种因资源耗尽而灭绝；而较高的 CheSL 香农均匀度可能在这种情况下有助于增加微生物群丰富度。

本研究结果与之前一些研究中关于碳水化合物复杂性与微生物群落组成和功能的关系相呼应。例如，Chung 等人和 Yao 等人的研究都表明，具有更高 CheSL 香农多样性的培养基能够支持更高水平的微生物群丰富度。虽然其他研究发现碳水化合物复杂性与微生物群丰富度之间的关系更为复杂，这可能是由于微生物群落裂解连接的能力差异以及复杂多糖降解依赖于特定的碳水化合物活性酶（CAZymes）。如果微生物群落中缺乏能够分解复杂多糖中独特连接的酶，单糖就无法被利用，也就无法提供独特的生态位。因此，在分析更多碳水化合物混合物和微生物群落时，CheSL 多样性与微生物群丰富度之间的相关性会降低。但研究人员认为，在了解目标复杂群落中 CAZyme 多样性的前提下，CheSL 的预测准确性可以得到提高。

在本研究中，在 CheSL 香农多样性最高的培养基（B、AP 和 ILC）中培养的样本，其微生物相互作用网络结构和共享微生物群丰富度之间的相似性更高。这表明由连接的丰度和均匀度推断的营养生态位多样性可能控制着连续流生物反应器中复杂微生物样本群落组装的可重复性，进而影响样本的共享微生物群丰富度。此外，研究还发现本研究中形成的群落存在与体内系统相似的富集和微生物关联，例如Bacteroides和Lachnospiraceae之间的关系，以及Clostridium sensu stricto和Bifidobacterium在高淀粉饮食相关培养基中的出现，这表明体外系统能够支持具有代表性的群落。

在 CheSL 香农多样性高的条件下形成的群落还表现出氨基酸潜在 Stickland 发酵基因的富集，并且这些培养基中肽的消耗水平更高。虽然通常蛋白水解发酵与负面健康结果相关，但在本研究中，肽的消耗发生在膳食纤维存在且富含丁酸产生基因的群落中，这表明微生物群的潜在有益功能得以维持。未来还需要进一步研究这种肽利用在其他微生物群落和培养基类型中的保守性。

利用本研究中数据分析和建模的方法，研究人员深入了解了粪便细菌之间的关系以及特定底物可用性下的潜在相互作用景观。以 CheSL 香农多样性为指导设计体外培养基，有望提高体外群落与粪便样本中群落的相似性和可重复性，避免引入未知的饮食成分。通过改善连续流条件下群落组装的可重复性，能够更好地检测样本和反应器之间的差异，为未来微生物代谢相互作用的机制研究提供帮助。

材料和方法

1. 样本采集：粪便样本来自两名自认为健康且在过去两个月内未使用过抗生素的成年志愿者。样本在厌氧条件下均质化，分装到厌氧管中，并在 - 80°C 下保存，直至培养。回肠造口流出物来自因先前疾病或损伤而进行造口术的参与者，样本在 - 20°C 下保存，使用前需解冻、过滤并与基础培养基一起高压灭菌。所有样本采集均获得了参与者的知情同意，并经过密歇根州立大学机构审查委员会批准（10 - 736SM）。
2. 培养基制备：微生物在生物反应器基础培养基中培养，该培养基的碳水化合物组成有所不同。基础培养基包含多种成分，经过高压灭菌后，再添加经过滤灭菌的其他成分，如碳酸氢钠、菊粉、阿拉伯半乳聚糖、可溶性淀粉等。不同的培养基变体（如 NS、MM、5MM、GP、GM、AP、AM、IL 和 ILC）通过添加不同种类和浓度的碳水化合物来制备，以测试碳水化合物组成和浓度对微生物群落的影响。
3. 微生物培养：使用连续流微型生物反应器阵列（MBRAs）培养人类胃肠道微生物群落。MBRAs 模拟远端人类结肠腔的环境参数，能够使群落保持稳定状态。在接种前，粪便样本需解冻并在厌氧磷酸盐缓冲液（PBS）中均质化为 20% wt/vol 的浆液。实验分两次进行，第一次实验中，FSA 在 NS、MM 或 IL 培养基中培养，FSB 在 NS、MM、5MM 或 IL 培养基中培养；第二次实验中，FSA 在 B、GP、GM、AP、AM 和 ILC 培养基中培养。培养过程中，连续流在接种 16 小时后以 0.94 mL/h 的速度启动，每天或每 12 小时收集约 1 mL 样本，MBRAs 在厌氧培养箱中保持 37°C，气体氛围为 90% N₂、5% CO₂和 5% H₂。
4. 16S rRNA 基因扩增子测序：对机械破碎细胞中的 16S rRNA 基因 V4 区域进行扩增，使用广泛范围的 16S rRNA 引物 515F/805R。纯化后的扩增子等摩尔浓度混合，使用 Illumina MiSeq v2 进行测序。测序数据使用 mothur V1.35.0 进行处理，包括序列比对、去除嵌合体和污染序列、去噪以及分类学注释。下游分析在 R 中使用 phyloseq 包进行，相关代码和 ASV 表可在https://github.com/HughMcCullough/CheSL上获取。
5. 计算网络推断的数据预处理：由于 Lotka - Volterra 方程用于模拟基于生态位的种群动态效应，因此需要进行多个过滤步骤以减少虚假相互作用。在培养早期，群落稳定性受非存活细胞稀释导致的 ASV 存在损失和群落适应培养条件时的伙伴切换等因素影响。为了提高 LIMITS 推断模型的拟合质量，研究人员测试了滑动窗口方法，对不同大小的窗口（6 - 15 个时间点）进行测试，并对 ASV 进行过滤，要求在所有时间点至少有一次读数，以避免因检测阈值上下波动的分类群影响模型推断。经过过滤后得到 “共享微生物群丰富度”，代表在不同时间点始终存在的 ASV 数量。
6. 使用 LIMITS 推断种间相互作用：使用 R 中的 seqtime 包进行 LIMITS 分析。在运行 LIMITS 之前，先对数据进行预处理，然后采用滑动窗口方法应用 LIMITS 算法。通过比较模拟数据和实验数据的平均互相关来量化模型拟合质量。从每个重复和窗口中推断出网络，并通过计算同一粪便样本和培养基培养条件下重复网络的共识来识别保守相互作用，经过平均相互作用值计算和共识阈值（至少两个网络识别出相同方向的相互作用）过滤后，得到每种培养基类型的整体网络。
7. 化学亚基和连接多样性的表征：如结果部分所述，研究人员开发了 CheSL 丰富度、CheSL 香农多样性和 CheSL 香农均匀度指标来计算碳水化合物混合物的复杂性。根据文献中多糖（如阿拉伯半乳聚糖、淀粉等）的组成和连接数据，以及二糖（如麦芽糖、纤维二糖等）和果聚糖的相关信息，对不同碳水化合物的连接多样性进行估计，进而计算 CheSL 指标。
8. 统计分析：对于培养基共享丰富度的比较，由于其不符合正态分布且数据过度分散，不适合用 Poisson 分布，因此使用 R 包 MASS 中的负二项式广义线性模型（glm.nb）进行分析。使用 R 包 emmeans 进行成对比较，并使用 Tukey’s HSD 调整多重比较的错误率。使用 R 包 ggpubr、tidyverse 和 ggplot2 进行相关性分析和可视化，计算多样性指标之间的皮尔逊相关性。
9. 推断代谢功能潜力：在使用 Cytoscape 对保守相互作用进行表征和可视化后，研究人员使用 PICRUSt2 从具有相似 16S rRNA 基因序列的完全测序分离株中推断培养物的酶委员会途径丰度，并使用 STAMP 评估 Pfam 途径丰度的潜在显著性。
10. 直链淀粉 / 支链淀粉比例的测量：使用 NEOGEN Megazyme 直链淀粉 / 支链淀粉检测试剂盒（产品代码 K - AMYL），按照制造商的说明进行操作，以测量本研究中使用的可溶性淀粉中直链淀粉和支链淀粉的比例，该比例用于计算 CheSL 多样性指标。
11. 微生物丰度的差异分析：使用 DESeq2 对在基础生物反应器培养基（B）和不同碳水化合物组成培养基中培养的群落进行差异丰度分析。DESeq2 模型将培养基类型作为解释群落组成的函数，时间作为协变量。此外，还对由聚合物形式（淀粉 [GP] 和阿拉伯半乳聚糖 [AP]）和相应单体形式（葡萄糖 [GM] 和半乳糖与阿拉伯糖 [AM]）组成的培养基中培养的群落进行 DESeq2 分析，以研究单糖