细胞介导免疫反应在牛结节皮肤病诊断中的新突破

《Microbiology Spectrum 3.7》：Evaluation of an interferon-gamma release assay for early detection of lumpy skin disease virus infection and vaccination in cattle

本研究聚焦于牛结节皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus, LSDV）感染及疫苗接种后的细胞介导免疫（Cell-Mediated Immune, CMI）反应，通过优化干扰素-γ释放试验（Interferon-Gamma Release Assay, IGRA），实现了对LSDV暴露的早期检测，为疾病防控提供了有力工具。

　　 牛结节皮肤病（Lumpy Skin Disease, LSD）是由牛结节皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus, LSDV）引起的一种严重危害牛群健康的传染病。该病在全球范围内对畜牧业造成了巨大的经济损失。目前，对于LSDV感染或疫苗接种后的免疫反应评估主要依赖于血清学检测，但这些方法存在灵敏度不足、检测时间长以及需要生物安全等级3（Biosafety Level 3, BSL3）实验室等限制。此外，部分动物可能出现延迟或不完全的血清转化现象，这进一步凸显了开发一种能够在BSL2实验室条件下应用的、基于细胞介导免疫反应的替代免疫检测方法的必要性。 鉴于细胞介导免疫（Cell-Mediated Immune, CMI）反应在抵抗痘病毒（poxvirus）感染中的重要作用，本研究深入探讨了干扰素-γ释放试验（Interferon-Gamma Release Assay, IGRA）在检测LSDV感染和疫苗接种中的应用潜力。IGRA是一种通过检测免疫细胞在体外再次受到抗原刺激时释放的干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）来评估机体对特定病原体免疫反应的试验方法。研究团队在实验条件下收集了牛接种基于Neethling株的减毒活疫苗（Live Attenuated Vaccine, LAV）后3周以及LSDV感染后4周的样本，旨在：（i）研究CMI反应的发展规律；（ii）优化IGRA试验，比较全血（Whole Blood, WB）和外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）两种基质以及不同刺激物的效果；（iii）评估IGRA在感染和疫苗接种检测中的实用性。 研究结果显示，对于接种Neethling LAV的牛，CMI反应在接种后10天即可被检测到，并且这一反应先于抗体的产生。在LSDV感染的牛中，CMI反应在感染后7天即达到平台期水平，同样早于抗体的检测。全血和PBMCs都能有效促进IFN-γ的分泌，但PBMCs中的IFN-γ反应显著更高。热灭活抗原被证实是LSD IGRA的最佳刺激物选择，它不仅提高了检测的灵敏度，还使得试验能够在BSL2条件下进行。在多种条件下，LSDV IGRA显示出高达100%的特异性。这些结果表明，LSD IGRA有望成为一种强大的免疫检测方法，可用于早期检测LSD以及疫苗接种后的监测。研究建议进一步在更多动物和实地条件下探索其诊断特性。 本研究的实验部分严格遵循伦理审批要求，在BSL3设施中进行。选取了12头6个月大的无疾病症状且对LSDV、蓝舌病毒（Bluetongue Virus, BTV）和牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV）血清阴性的公牛（Bos taurus），分为接种疫苗组（VAC, n=7）和感染组（INF, n=5）。动物在适应期后，接种组牛接受Neethling LAV的皮下注射（Subcutaneously, s/c），感染组牛则通过静脉（Intravenously, i/v）和皮内（Intradermally, i/d）注射的方式接种重组LSDV越南株。样本在接种后0、3、7、10、14、17、21天以及感染后24天和28天收集。 在IGRA试验中，研究团队比较了全血和PBMCs两种基质的效果。全血IGRA试验中，将1.5 mL的抗凝全血置于24孔板中，加入100 μL的刺激抗原后在37°C、5% CO?条件下孵育20小时。随后收集上清液，采用商业化的IFN-γ ELISA试剂盒（ID Vet, Montpellier, France）进行检测。PBMCs IGRA试验中，将相当于1.5 mL全血中PBMCs数量的细胞悬液（417 μL）加入24孔板中，加入100 μL的刺激物，并添加183 μL的培养基以达到与全血IGRA相似的体积。孵育条件和检测方法与全血IGRA相同。 研究中还对不同刺激物的效果进行了评估，包括活病毒、紫外线（Ultraviolet C, UVC）灭活病毒和热灭活病毒。结果显示，热灭活病毒作为刺激物时，IGRA的灵敏度最高，且在BSL2条件下即可进行检测。这为IGRA的广泛应用提供了便利。 在疫苗接种后的CMI反应监测中，IGRA能够在接种后7天检测到IFN-γ的释放，并在10天后所有动物均呈阳性反应。这一反应早于抗体的产生，表明IGRA可以作为早期检测疫苗接种效果的有力工具。在LSDV感染后的CMI反应监测中，IGRA同样表现出色，所有动物在感染后7天即呈现高水平的IFN-γ反应，并持续至28天。这一结果进一步证实了IGRA在早期感染检测中的优势。 此外，研究还对IGRA的特异性和灵敏度进行了评估。在疫苗接种前的样本检测中，全血IGRA显示出100%的特异性，而PBMCs IGRA的特异性为71.43%。在感染组动物中，全血IGRA在感染前样本检测中未出现非特异性反应，显示出高特异性。在灵敏度方面，IGRA在疫苗接种和感染后均表现出色，能够检测到所有阳性动物。 本研究的成果不仅为牛结节皮肤病的早期诊断和疫苗接种效果监测提供了新的思路和方法，还强调了细胞介导免疫反应在痘病毒免疫中的重要性。通过优化IGRA试验，研究团队成功克服了传统血清学检测方法的局限性，为未来在BSL2实验室条件下广泛应用IGRA检测LSDV感染和疫苗接种效果奠定了坚实基础。未来的研究将进一步在更多动物和实地条件下验证IGRA的诊断特性，以期为牛结节皮肤病的防控提供更有力的支持。