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本研究通过在脑脊液（CSF）和粪便样本中添加NIST参考材料（RM 8376），评估了宏基因组学工作流的分析性能，为临床诊断应用提供了重要参考。
本研究旨在评估宏基因组学工作流在不同样本类型中的分析性能，以推动其在临床诊断中的应用。研究使用了NIST参考材料（RM）8376，这是一种包含19种病原体细菌DNA的参考材料，用于评估检测限（LOD）、线性响应和动态范围等关键性能指标。
研究背景
宏基因组学（mNGS）作为一种“无偏见”的诊断手段，具有巨大的临床应用潜力。它通过对样本中的DNA和/或RNA进行提取、建库、测序和生物信息学分析，实现对样本中微生物的鉴定。然而，将mNGS技术转化为临床应用需要对其分析性能进行严格评估，尤其是在检测限、线性响应和动态范围等方面。NIST参考材料（RM）8376的发布为这一需求提供了支持，它包含19种病原体细菌DNA，可用于评估mNGS工作流的性能。
研究方法
研究选择了两种临床样本类型：脑脊液（CSF）和粪便。CSF样本来自五名健康志愿者，经过提取和混合后，添加了两种内部对照菌（嗜水气单胞菌和嗜肺军团菌）和四种目标菌（肺炎克雷伯菌、脑膜炎奈瑟菌、粪肠球菌和单核细胞增生李斯特菌）作为 spike-in。粪便样本则使用了候选粪便参考材料，经过提取和混合后，同样添加了内部对照菌和目标菌。所有样本均进行了DNA提取、建库和测序，测序平台为Illumina MiSeq。
实验结果
脑脊液（CSF）样本
在CSF样本中，检测限（LOD）范围为100到300拷贝/mL，线性响应范围为0.96到0.99。研究发现，CSF样本的背景信号较低，适合用于mNGS分析。通过线性回归分析，确定了每个目标菌的LOD，并发现这些值在统计上虽有差异，但数量级相近。此外，研究还比较了Centrifuge和Kraken2两种分类器的性能，结果表明两者在CSF样本中的表现相似。
粪便样本
在粪便样本中，检测限（LOD）范围为10到221 k拷贝/mL，线性响应范围为0.99到1.01。粪便样本的背景信号远高于CSF样本，这主要是由于粪便中微生物种类繁多且浓度较高。研究发现，尽管LOD存在显著差异，但不同样本类型中相同目标菌的线性响应函数却保持一致，表明mNGS工作流对特定目标菌的响应不受样本类型的影响。
大肠杆菌（E. coli）菌株的区分能力
研究还测试了mNGS工作流区分致病性大肠杆菌和共生大肠杆菌的能力。使用Centrifuge分类器和其默认数据库，能够正确区分两种致病性大肠杆菌（O157:H7和O104:H4）和共生K12菌株。然而，使用Web of Life数据库时，K12菌株被错误地识别为两种致病性菌株。此外，Kraken2工作流未能检测到O104:H4菌株，但能够正确区分O157:H7菌株和K12菌株。
结论
NIST参考材料（RM）8376能够有效评估mNGS工作流的分析性能，为临床应用提供了重要的参考数据。研究结果表明，mNGS工作流在不同样本类型中的分析响应具有一致性，但检测限受到样本背景信号的影响。此外，分类器和数据库的选择对mNGS工作流的性能有显著影响，特别是在区分近缘菌株时。未来的研究需要进一步探索更多样本类型和完整工作流的性能，以推动mNGS技术在临床诊断中的广泛应用。
