沙眼衣原体效应蛋白 Tarp 的 N 端区域对宿主 Hippo 信号通路的调控新发现

《Microbiology Spectrum 3.7》：The N-terminus of the Chlamydia trachomatis effector Tarp engages the host Hippo pathway

研究揭示沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）效应蛋白 Tarp 的 N 端可改变宿主 Hippo 信号，影响细胞增殖与生存。

　　### 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）的威胁与谜团
沙眼衣原体是一种革兰氏阴性、专性细胞内寄生菌，在全球范围内，它是导致感染性失明的主要原因。在美国，它更是最常见的性传播感染（STI）病原体，其感染率逐年上升，给公共卫生带来了沉重的负担。尽管沙眼衣原体如此猖獗，但它促进感染的许多分子策略仍未完全明晰。

宿主细胞入侵是沙眼衣原体感染的关键起始步骤。在附着到宿主细胞表面后，沙眼衣原体通过 III 型分泌系统向宿主细胞注入多种细菌效应蛋白。这些 “早期效应蛋白” 协同作用，促进细菌高效入侵宿主细胞。其中，转位肌动蛋白招募磷蛋白（translocated actin-recruiting phosphoprotein，Tarp）是研究最为深入的早期效应蛋白之一。研究表明，Tarp 对于沙眼衣原体有效入侵宿主细胞至关重要。在体外实验中，Tarp 的 C 端区域能够促进 F - 肌动蛋白的形成，并使已有的 F - 肌动蛋白丝成束，这一功能在细菌进入宿主细胞过程中发挥着重要作用。

然而，Tarp 的 N 端区域（N-Tarp）功能却鲜为人知。Tarp 是一个约 1000 个氨基酸的蛋白质，其 N 端缺乏明确注释的功能结构域，但在多种沙眼衣原体物种中均存在。值得注意的是，沙眼衣原体的 N-Tarp 含有富含酪氨酸的重复序列，在进入宿主细胞后会迅速磷酸化。这种磷酸化修饰可能激活多种信号通路，但 N-Tarp 在沙眼衣原体感染过程中的具体功能仍有待探索。

利用果蝇（Drosophila melanogaster）探索 N-Tarp 功能

为了深入研究 N-Tarp 的功能，研究人员利用果蝇作为体内细胞生物学研究平台。果蝇具有丰富的遗传工具、试剂和技术，其细胞和发育生物学知识也较为完善。通过在果蝇中进行转基因表达实验，研究人员可以在无感染干扰的情况下，单独研究效应蛋白的功能，还能利用遗传工具将效应蛋白靶向特定细胞或组织表达，并根据果蝇组织中效应蛋白表达所引起的表型来推断其功能。

研究人员首先观察到，在果蝇中过表达 N-Tarp 会导致一些表型，如刚毛重复，这与 Hippo 信号通路的破坏有关。Hippo 信号通路是一条高度保守的信号通路，在动物发育过程中控制细胞增殖和细胞生存，确保器官大小的正常发育。该通路核心是一个激酶级联反应，控制转录共激活因子 Yorkie（哺乳动物中为 YAP/TAZ）的核定位。Yorkie 与 DNA 结合蛋白 Scalloped（哺乳动物中为 TEAD）一起作为转录因子，驱动下游靶基因的表达，如细胞周期蛋白 E（Cyclin E，CycE）和果蝇凋亡抑制因子 1（Drosophila inhibitor of apoptosis 1，Diap1），这些基因分别调节细胞周期和细胞凋亡。

基于上述观察，研究人员以果蝇翅膀发育为模型，进一步研究 N-Tarp 与 Hippo 信号通路之间的相互作用。

N-Tarp 表达导致果蝇翅膀组织过度生长

果蝇的 Imaginal discs（幼虫组织）是成虫主要结构的前体，如触角、眼睛、腿和翅膀等。其中，翅膀的 Imaginal discs（翼盘）在幼虫生长过程中会按比例增大，这种生长由细胞增殖和组织模式形成共同驱动，且受到 Hippo 信号通路的调控，因此翼盘是研究 Hippo 信号通路的理想组织。

研究人员利用nubbin-GAL4（nub-GAL4）驱动蛋白在翼盘的翼袋区域表达 N-Tarp。通过测量 GFP 阳性组织的面积，发现 N-Tarp 表达导致翼袋面积比对照组明显增大。同时，过表达 Hippo 信号通路的转录共激活因子 Yorkie 也会使翼袋面积增加，这与之前的研究结果一致。

当nub>N-Tarp 幼虫发育为成虫后，研究人员发现，绝大多数（94.9%）的成虫翅膀出现褶皱、未展开的现象。而极少数（5.1%）完全展开翅膀的成虫，其翅膀面积比对照组大得多。为了增加可分析的完全展开翅膀的数量，研究人员使用ptc-GAL4 驱动蛋白，将 N-Tarp 的表达限制在成虫翅膀沿前后边界的一个小区域。结果发现，这种情况下 N-Tarp 的表达不会干扰翅膀展开，且使翅膀面积增大。通过测量ptc-GAL4 区域前后边界之间的翼缘长度，发现多个 N-Tarp 转基因品系均导致翼缘长度增加，这种增加与 Yorkie 过表达引起的效果相似。

进一步研究发现，N-Tarp 表达导致翅膀尺寸增大可能是由于细胞数量增加，而非单个细胞大小的变化。研究人员通过计数覆盖翅膀表面的微小刚毛（trichomes）数量来量化细胞密度，结果发现对照组、N-Tarp 表达组和 Yorkie 过表达组的翅膀 trichomes 密度没有变化，这表明 N-Tarp 表达导致的翅膀增大是由细胞增殖引起的。

N-Tarp 引起 Hippo 信号通路靶基因上调

上述实验表明，N-Tarp 诱导的组织过度生长表型与 Yorkie 过表达引起的变化相似。为了进一步证实 N-Tarp 与 Hippo 信号通路之间的联系，研究人员检测了经典 Hippo 靶基因的表达是否因 N-Tarp 的存在而改变。

研究人员使用了两种遗传编码的 Hippo 信号通路报告基因：bantam-GFP 和ex-LacZ。在正常情况下，对照翼盘的翼袋区域bantam基因表达水平较低，GFP 荧光较弱，仅有少量区域呈现中等活性。而当 N-Tarp 在翼袋区域表达时，bantam基因表达显著增加，表现为中等 GFP 荧光强度区域扩大，且出现高活性区域。通过对线性感兴趣区域（ROI）的 GFP 荧光强度进行定量分析，发现多个翼盘样本中，N-Tarp 表达均导致bantam基因表达水平持续升高。同样，使用ex-LacZ 报告基因检测另一个经典 Hippo 通路靶基因expanded的表达，也得到了类似的结果。这些结果从分子层面证明了 N-Tarp 表达会改变 Hippo 信号通路的活性。

破坏 Hippo 信号通路可挽救 N-Tarp 诱导的翅膀过度生长表型

为了证明 N-Tarp 的功能是通过 Hippo 信号通路发挥作用的，研究人员进行了遗传挽救实验。他们通过破坏（i）Yorkie 转录因子或（ii）经典 Hippo 靶基因Diap1和CycE，试图挽救 N-Tarp 诱导的褶皱翅膀表型。

研究人员在yki^+/-杂合缺失果蝇的翼袋中表达 N-Tarp。由于降低yki基因剂量会导致 Yorkie 蛋白水平降低，且不会显著影响动物的生存能力（相比之下，使用 RNAi 敲低翼袋中yki的表达会导致较高的致死率）。结果发现，在野生型背景下表达 N-Tarp，几乎所有果蝇都出现异常翅膀，且褶皱翅膀频率很高；而在yki^+/-背景下表达 N-Tarp，褶皱翅膀的频率显著降低，出现了中间波浪形翅膀表型，并且有正常直翅膀果蝇出现。

同时，研究人员在翼袋中表达 N-Tarp 的同时，通过 RNAi 敲低Diap1或CycE的表达。结果显示，敲低Diap1或CycE会使 N-Tarp 诱导的翅膀表型分布更倾向于中间波浪形或完全直翅膀。这些结果表明，破坏 Hippo 信号通路能够部分挽救 N-Tarp 诱导的翅膀过度生长表型，有力地证明了 N-Tarp 在体内通过 Hippo 信号通路发挥功能。由于 Hippo 信号通路对动物生存至关重要，无法在完全缺失 Yorkie、Diap1或CycE的背景下研究 N-Tarp 的功能，这也解释了遗传挽救实验效果不完全的原因。

研究结论与展望

综合以上研究，利用果蝇细胞和发育生物学平台，研究人员发现沙眼衣原体效应蛋白 Tarp 的 N 端区域能够改变宿主 Hippo 信号通路的活性，且作用于转录共激活因子 Yorkie 的上游，导致 Hippo 靶基因表达增加。这一发现不仅为 Tarp 的 N 端区域赋予了新的功能，也表明 Tarp 在宿主细胞入侵之外可能发挥着重要作用。

此外，沙眼衣原体感染细胞对凋亡具有抗性，而 Hippo 信号通路的激活与细胞生存相关。研究人员推测，沙眼衣原体可能通过 Tarp 的 N 端区域激活 Hippo 信号通路，增加凋亡抑制蛋白（IAP）水平，从而确保宿主细胞在感染过程中存活。

同时，许多其他病原体也进化出了操纵宿主 Hippo 信号通路以促进感染的策略。例如，嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）分泌的效应蛋白 LegK7 可直接磷酸化 Hippo 通路核心激酶级联中的 MOB1（果蝇中为 Mats），改变宿主转录反应；查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）分泌的 TRP120 可下调 Hippo 信号，导致抗凋亡 Hippo 靶基因SLC2A1/GLUT1表达增加；人乳头瘤病毒（HPV）的 E6 蛋白可直接与 Hippo 通路的多个成员相互作用，促进组织病变形成。这表明 Hippo 信号通路是病原体感染过程中的一个重要靶点，也凸显了研究沙眼衣原体与 Hippo 信号通路相互作用的重要性。

未来的研究可以进一步探索 N-Tarp 与 Hippo 信号通路相互作用的分子机制，确定 N-Tarp 在 Hippo 信号通路中的具体作用位点。此外，结合临床样本分析，研究沙眼衣原体感染患者体内 Hippo 信号通路的变化，有助于深入了解沙眼衣原体感染的病理过程，为开发新的治疗策略提供理论依据。