探秘阴沟肠杆菌复合群：耐药机制与精准防控新进展

《Microbiology Spectrum 3.7》：Molecular epidemiology and β-lactam resistance mechanisms of Enterobacter cloacae complex isolates obtained from bloodstream infections, Kyoto, Japan

本文通过多方法研究阴沟肠杆菌复合群（ECC），揭示其耐药机制等，为防控感染提供依据。

　　# 探秘阴沟肠杆菌复合群：耐药机制与精准防控新进展
阴沟肠杆菌复合群（Enterobacter cloacae complex，ECC）是一类在医院感染中 “兴风作浪” 的致病菌，常常引发呼吸道、手术伤口、泌尿道以及血液等部位的感染 ，给临床治疗带来诸多挑战。

一、ECC 的 “前世今生” 与研究背景

ECC 能产生染色体诱导型 AmpC β- 内酰胺酶，这使得它们对氨苄西林、第一代头孢菌素和头霉素天然耐药。而第三代头孢菌素（3GCs），像头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶等，虽一开始能 “压制” 野生型 ECC，但在治疗过程中，由于 ECC 容易发生自发突变，导致 AmpC 去阻遏，使得这些抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）升高，治疗效果大打折扣，甚至出现治疗失败的情况。

在菌种分类上，ECC 包含多个物种，传统基于生化特性、质谱或 hsp65 的鉴定方法不够精准，全基因组测序（WGS）技术的出现，为准确分类提供了有力支持。目前，通过 WGS 已定义了至少 24 个物种和 14 个潜在分类单元。不同物种在致病性和耐药性方面存在差异，比如，香芳肠杆菌（Enterobacter xiangfangensis）和霍夫曼肠杆菌（Enterobacter hoffmannii）与菌血症患者较高的死亡率、更长的住院时间以及更高的耐药率相关。因此，精准识别 ECC 物种，探究其耐药机制，对临床治疗和感染防控意义重大。

二、研究大揭秘：多管齐下探究 ECC

研究人员收集了 2002 年 2 月至 2018 年 12 月期间，日本京都大学医院血培养中分离出的非重复头孢噻肟敏感（CTX-S）临床 ECC 菌株。首先，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术初步鉴定菌株。接着，采用肉汤微量稀释法，依据 2022 年临床和实验室标准协会（CLSI）指南，进行抗菌药物敏感性测试（AST），评估菌株对多种抗菌药物的敏感性。

在探究 AmpC 诱导和检测方面，研究人员确定了 8μg/mL 头孢西丁为最佳诱导浓度。对于 AmpC 去阻遏突变体的检测，将细菌悬液培养后，对不同处理的培养物进行系列稀释，接种在含或不含 8μg/mL 头孢噻肟的培养基上，通过计算菌落数来确定突变频率。

在基因层面，研究人员运用 Illumina DNA Prep 试剂盒制备测序文库，在 Illumina NovaSeq 6000 或 NextSeq 1000 平台上进行测序。利用 SPAdes 3.15.4 软件获得草图基因组，Prokka v1.14.5 软件进行注释，通过平均核苷酸同一性（ANI）与已知菌株对比来鉴定物种。借助 AMRFinderPlus 数据库和多位点序列分型（MLST）等工具，明确基因及其等位基因的存在情况，并构建核心单核苷酸多态性（SNP）系统发育树。最后，运用 R 软件进行统计分析，比较不同组之间的差异。

三、研究成果大放送

（一）菌种和克隆分布 “曝光”

在 194 株非重复血流 ECC 分离株中，WGS 分析鉴定出 13 个物种和 6 个未命名分类单元。香芳肠杆菌最为常见，占比达 36%，随后是路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii，13%）、科贝肠杆菌（Enterobacter kobei，12%）和阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae，12%）。霍夫曼肠杆菌在头孢噻肟耐药（CTX-NS）和敏感菌株中的分布差异显著，在 CTX-NS 菌株中占比 14%，而在 CTX-S 菌株中仅占 3%。

研究还发现了 114 种序列类型（STs），其中 46 种为新发现的类型。CTX-S 和 CTX-NS 菌株中常见的 STs 不同，但也有 16 种 STs 在两组中都存在。部分 CTX-NS 菌株携带超广谱 β- 内酰胺酶（ESBLs）基因，如 ST78、ST252 和 ST133 菌株。

（二）AST 与耐药基因 “现形”

CTX-NS 菌株对所有测试抗菌药物的耐药率均高于 CTX-S 菌株。CTX-S 菌株对多种抗菌药物，如头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林 / 他唑巴坦、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素和阿米卡星均敏感。在 CTX-NS 菌株中，15% 携带 ESBL 基因，3% 携带碳青霉烯酶基因，1% 携带质粒介导的 AmpC 基因，其中最常见的 ESBL 基因是 bla_CTX-M-3 。

在 14 株头孢吡肟耐药菌株中，9 株携带 ESBL 基因，其余菌株虽未携带常见 β- 内酰胺酶基因，但携带广谱 β- 内酰胺酶基因。ST78 和 ST93 在头孢吡肟耐药菌株中较为常见，且常携带 ESBLs。此外，研究还发现部分抗菌药物耐药基因在 CTX-NS 菌株中携带频率更高。

不同菌种的耐药情况也各有特点，霍夫曼肠杆菌对多种抗菌药物耐药率最高，阿氏肠杆菌对黏菌素耐药率最高。添加 8μg/mL 头孢西丁后，除 1 株菌株外，其余 CTX-S 菌株的头孢噻肟、头孢他啶、哌拉西林 / 他唑巴坦和头孢吡肟的抗菌效果受到拮抗。

对比 2002 - 2010 年和 2011 - 2018 年的菌株，发现物种分布无显著差异，但 ST32 的流行率、妥布霉素耐药率和 bla_CTX-M-3的携带率在 2010 年后显著下降，部分抗菌药物耐药率也有所降低，但未达统计学意义。

（三）突变分析 “有料”

在 50 株随机选择的 CTX-S 菌株中，研究人员发现 AmpC 去阻遏突变体在无抗菌药物和含头孢西丁的培养物中出现频率较高，且突变频率相似。当培养物中同时含有头孢西丁和头孢噻肟时，突变体出现频率虽相对较低，但突变频率显著高于前两者。

从 8 株菌株中获得 64 个突变体，所有突变体均存在 ampD 基因突变，包括错义突变、移码突变、缺失或截断突变以及无义突变等多种类型。部分突变体还存在 ampD 基因以外的非沉默突变或沉默突变。这些突变体对头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南和哌拉西林均耐药，42% 的突变体对头孢吡肟耐药（MIC 为 4 - 8μg/mL，属敏感剂量依赖性），99% 的突变体对哌拉西林 / 他唑巴坦耐药，而对其他抗菌药物的敏感性未发生改变。

四、深度剖析研究成果

（一）菌种鉴定的 “门道”

准确鉴定 ECC 菌种对了解其临床和微生物学特性至关重要，WGS 分析比传统鉴定方法更精准。以往研究和本次研究都表明，香芳肠杆菌是常见物种，但不同地区其他常见物种有所差异，如在中国和瓜德罗普岛等地，常见物种组合各不相同，日本研究中路德维希肠杆菌较为常见，而在其他国家则较少见，这体现了区域差异。同时，不同菌种对抗菌药物的耐药性存在差异，霍夫曼肠杆菌对多种药物耐药，阿氏肠杆菌等与黏菌素耐药相关。

（二）CTX - NS 率与耐药机制 “解读”

本次研究中 38% 的菌株对头孢噻肟耐药，与以往报道的 29% - 58% 相符。ESBLs 是导致头孢噻肟耐药的常见获得性 β- 内酰胺酶，84% 不含这些酶的头孢西丁耐药菌株被认为具有 AmpC 去阻遏表型。不同地区和研究中，ESBL 基因的流行率和类型有所不同，在日本和中国，bla_CTX-M-3和 bla_SHV-12较为常见，且与高风险克隆 ST78 和 ST93 相关。碳青霉烯酶在本研究菌株中较少见，反映了当地的流行病学特点。此外，CTX-NS ECC 克隆的传播和 AmpC 去阻遏突变体的散发性发展，共同导致了耐药菌株的增加。

（三）时间变化 “背后的故事”

虽然多药耐药 ECC 有增加趋势，但本研究中未发现去阻遏突变体增加的情况。研究期间，菌株的物种 / 克隆分布未发生显著变化，抗菌药物耐药率和 ESBL 基因携带率呈下降趋势，不过目前还不清楚具体原因，可能与治疗策略未改变和未发生疫情暴发有关。

（四）突变实验 “的启示”

研究中 AmpC 去阻遏突变体的突变频率与以往报道相近，在含头孢噻肟和头孢西丁的培养条件下，突变频率增加且遗传变异多样性降低，表明这些条件会筛选出突变体。42% 的突变体对头孢吡肟耐药，且多数对哌拉西林 / 他唑巴坦耐药，这意味着对于 CTX-S ECC 感染，尤其是严重感染或与强效 AmpC 诱导剂联合使用时，头孢吡肟和哌拉西林 / 他唑巴坦可能并非最佳治疗选择。

当然，本研究也存在一些不足。样本数量有限，无法全面反映 ECC 的多样性和耐药模式；研究仅涉及一家机构，结果的普遍性受限；未能深入探究 CTX-NS 菌株的耐药机制；未研究孔蛋白和外排泵突变；突变实验条件有限，可能遗漏部分突变体。

总体而言，本研究揭示了日本京都地区血流 ECC 分离株的分子流行病学特征和 β- 内酰胺耐药机制，包括物种分布、耐药谱、耐药基因以及突变体的耐药情况等。这些成果有助于深入了解 ECC 的耐药机制，为制定合理的抗菌治疗方案和感染控制策略提供了重要依据。未来，还需要开展更多多中心、大样本的研究，结合临床数据，持续关注 ECC 的耐药变化，以更好地应对这一临床挑战。