养殖亚洲鲈鱼肠道微生物群的奥秘：环境与宿主因素的交织影响

《Microbiology Spectrum 3.7》：Spatial and temporal changes in gut microbiota composition of farmed Asian seabass (Lates calcarifer) in different aquaculture settings

本文研究了养殖亚洲鲈鱼肠道微生物群，发现其受养殖环境等多种因素影响，对水产养殖意义重大。

　　

引言

养殖鱼类作为全球人类日益重要的食物来源，其健康状况直接关乎水产养殖业的经济效益和食品安全。以往对养殖鱼类微生物生态学的研究多聚焦于疾病暴发时的病原体鉴定，而对健康养殖鱼类的微生物群特征了解甚少。鱼类肠道微生物群在宿主的消化、代谢、应激反应、繁殖、发育以及病原体感染等过程中发挥着关键作用，因此，深入探究健康养殖鱼类的肠道微生物群组成具有重要意义。

亚洲鲈鱼（Lates calcarifer）是广泛养殖于印度 - 太平洋地区（包括新加坡）的鱼类品种。野生亚洲鲈鱼以鱼类和甲壳类为食，而养殖过程中投喂低价值鱼类的做法引发了对可持续性和环境影响的担忧。此外，与亚洲鲈鱼疾病相关的常见微生物，如耐药大肠杆菌、耐药副溶血性弧菌等已被研究，且养殖实践会影响宿主鱼类中耐药病原体的丰度。

以往鱼类肠道微生物群研究多集中于后肠，忽视了其他肠道分段。而硬骨鱼类作为脊椎动物中种类最多的类群，具有多样的生活史、个体发育和形态变化。不同鱼类的消化道分段存在差异，研究肠道微生物群在胃肠道主要分段的纵向变化，有助于揭示宿主解剖生理与细菌组成的关联，增进对宿主 - 微生物相互作用的理解，还能为发现益生菌、优化益生元配方提供依据。本研究旨在调查不同年龄和养殖条件下亚洲鲈鱼的微生物群，并与其他养殖鱼类进行比较，为针对性干预肠道微生物群奠定基础。

材料与方法

1. 采样地点和方法：从新加坡七个不同地点的农场获取 104 条养殖亚洲鲈鱼，体重范围为 38.9 克至 5.5 千克，标准体长在 11.6 厘米至 63 厘米之间。这些鱼分别在海笼、水箱中养殖，或经历从海笼到水箱的转移。选取 62 条体重在 400 克至 1 千克的商品规格鱼进行研究，它们来自六个农场。同时，纳入五条野生捕捞的亚洲鲈鱼（其中三条为商品规格），以及其他三种养殖鱼类，即遮目鱼（Chanos chanos）、红鲷鱼（Lutjanus malabaricus）和鲳鱼（Trachinotus sp）。所有鱼获取后置于冰中保存和运输，实验室中存于 - 80°C 冰箱直至解剖，通过形态学和 COI 基因测序鉴定鱼类身份。
2. 鱼肠道划分和采样：采集后的鱼在冰中保存和运输，使用无菌解剖工具提取肠道。亚洲鲈鱼的肠道分为胃、幽门盲囊、前肠、中肠和后肠五个部分。通过挤压肠道内容物减少宿主 DNA 含量，幽门盲囊内容物合并为一个样本，各分段内容物分别置于螺口管中，匀浆后 - 80°C 保存用于提取微生物基因组 DNA（gDNA）。其他三种养殖鱼类仅采集后肠样本，采样方法与亚洲鲈鱼相同。
3. 样本处理：按照先前方法提取肠道样本的 gDNA，使用 0.1 毫米直径氧化锆珠通过珠磨酚 - 氯仿萃取法进行。提取的 gDNA 经 Quant-it Picogreen 定量后，用于 PCR 反应。以 515F 和 806R 引物对 16S rRNA 基因的 V4 区域进行三次重复扩增，反应体系包含 30 ng gDNA 模板、终浓度为 0.2 μM 的上下游引物、0.4U New England BioLabs Q5 高保真 DNA 聚合酶等。PCR 反应条件为 94°C 预变性 3 分钟，然后进行 34 个循环，包括 94°C 变性 45 秒、50°C 退火 60 秒、72°C 延伸 1 分 30 秒，最后 72°C 延伸 10 分钟。PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳分析后，使用 AMPure XP 纯化，再用 Qubit 和 Nanodrop 检测 DNA 的量和质量，最后在新加坡基因组研究所的 Illumina MiSeq 平台上进行 151 bp 双端测序。
4. 序列处理和微生物群分析：测序结果按照先前方法使用 QIIME 2 2021.4 进行处理。导入正向 reads，进行去噪、去重复、嵌合体过滤和修剪等操作。使用 “qiime feature - table merge” 和 “qiime feature - table merge - seqs” 合并特征表和代表性序列，利用 “qiime feature - classifier classify - sklearn” 和 SILVA 138 SSU 99% 16S 515F/806R 区域数据库对扩增子序列变异（ASV）进行分类学鉴定。使用 “qiime diversity alpha - rarefaction” 生成 α - 稀疏曲线，根据曲线将稀疏深度设置为 4,029，使用 “qiime diversity core - metrics - phylogenetic” 生成稀疏特征表和多样性指标。
5. 统计方法概述：从 QIIME2 获得 ASV 表、分类学表和样本元数据，导入 R 进行统计分析和可视化。使用 phyloseq 处理测序结果，ggplot2 进行绘图，所有对数计算采用自然对数。
6. 统计分析：相对丰度、ANCOM - BC、NMDS、PERMANOVA：在门和属水平描述微生物的相对丰度，使用 R 包 genefilter 过滤相对丰度低于 0.5% 的门，标记为 “Others”。根据 FAO 列出的亚洲鲈鱼主要疾病及其感染病原体，整理出包含潜在致病物种的属，生成堆叠柱状图展示其相对丰度，并进行核心微生物群分析。使用 ANCOM - BC 包中的 ancombc2 函数计算差异丰富的分类群，在属水平进行分析。使用 vegan 和 BiodiversityR 包在 ASV 分辨率下生成非度量多维缩放（NMDS）图，计算拟合向量表示微生物分类群。使用 vegan R 包中的 adonis2 函数进行置换多元方差分析（PERMANOVA）。在 R 和 Python 中分别生成 ASV 与个体鱼之间的网络和条形图，网络使用 Prefuse 力导向布局展示。

结果

1. 养殖环境类型影响养殖亚洲鲈鱼肠道微生物群的 α 和 β 多样性：将野生和商品规格养殖亚洲鲈鱼的肠道样本按养殖环境分组，发现仅在海笼或水箱中养殖的鱼，其肠道微生物群的香农（Shannon）、辛普森（Simpson）和 Chao1 指数显著低于经历养殖环境类型变化的鱼。野生鱼与所有三种养殖环境类型的养殖鱼在 Shannon 和 Simpson 指数上无显著差异，野生鱼的 Chao1 指数显著低于环境转换的养殖鱼。按养殖环境和肠道分段分组样本后，除海笼养殖鱼的胃和幽门盲囊的 Chao1 指数存在显著差异外，同一养殖环境内各肠道分段的 α 多样性指数无显著差异。

通过加权 UniFrac 距离和 Bray - Curtis 相异度分析 β 多样性，发现同一养殖环境类型的鱼微生物群落更相似。PERMANOVA 测试表明，养殖环境类型显著影响加权 UniFrac 距离和 Bray - Curtis 相异度。此外，养殖农场和批次也对肠道微生物群有影响，PERMANOVA 量化结果显示，养殖环境类型、农场和批次分别解释了市场规格养殖亚洲鲈鱼加权 UniFrac 距离多样性的 10.42%、29.82% 和 10.70%，解释了 Bray - Curtis 相异度的 10.6%、15.8% 和 13.6%。

在门水平上，养殖环境类型影响肠道微生物群组成。脱硫杆菌门（Desulfobacterota）在所有四种养殖环境类型的鱼肠道分段中相对丰度均增加，变形菌门（Proteobacteria）在各养殖环境中均占优势，厚壁菌门（Firmicutes）在三种养殖环境中占优势，但在海笼转水箱的鱼中比例较低，放线菌门（Actinobacteriota）在海笼转水箱的鱼中更丰富。网络分析发现，养殖鱼存在农场特有的 ASV 和多个农场共享的 ASV，部分共享的高丰度 ASV 只能鉴定到属或科水平。2. 亚洲鲈鱼肠道中潜在鱼类病原体的流行情况：基于 FAO 列出的亚洲鲈鱼主要疾病感染病原体，分析样本中八个属的微生物，发现其中六个属（气单胞菌属Aeromonas、黄杆菌属Flavobacterium、假单胞菌属Pseudomonas、链球菌属Streptococcus、屈挠杆菌属Tenacibaculum和弧菌属Vibrio）以及发光杆菌属Photobacterium存在。这些属在不同养殖环境鱼类肠道中的分布不同，如野生鱼和海笼养殖鱼中发光杆菌属相对丰度较高，海笼与水箱间转移的鱼和水箱养殖鱼中弧菌属相对丰度较高，气单胞菌属仅存在于海笼与水箱间转移的鱼中。3. 微生物群沿肠道主要分段和鱼年龄的纵向变化：基于 Bray - Curtis 相异度的 NMDS 分析未发现明显趋势，但鉴定出亚洲鲈鱼肠道主要分段间存在差异丰富的微生物属。以后肠为参照，从胃到中肠差异丰富分类群的数量减少，除Brevinema外，胃和幽门盲囊中差异丰富分类群的对数折叠变化（LFC）高于后肠。随着鱼体长度（代表年龄）增加，差异丰富微生物属的 LFC 降低。

PERMANOVA 分析表明，在养殖亚洲鲈鱼中，“肠道分段” 对样本间 Bray - Curtis 相异度的贡献最大，其次是 “养殖环境类型”“宿主长度” 和 “体重”。加权 UniFrac 分析结果类似。4. 养殖鱼类物种间相似的肠道微生物群：比较亚洲鲈鱼与其他三种养殖鱼类（鲳鱼、红鲷鱼和遮目鱼）的后肠微生物群，发现亚洲鲈鱼后肠中有两个独特的核心 ASV，非亚洲鲈鱼养殖鱼类后肠中有一个独特的核心 ASV，两者共有四个核心 ASV。总体上，不同鱼类物种的样本存在宿主特异性聚类，PERMANOVA 表明鱼类物种对 β 多样性差异的贡献率为 14.11%，考虑农场和批次因素后为 8.49%。

讨论

1. 养殖环境类型对肠道微生物群的影响：经历养殖环境转换的亚洲鲈鱼肠道微生物群具有更高的 α 多样性和组成差异。鱼类在不同养殖环境间转移可能产生应激，影响肠道微生物群，如在大西洋鲑鱼研究中，应激会导致肠道微生物群中 γ - 变形菌门（Gammaproteobacteria）增加。野生鱼和海笼养殖鱼肠道微生物群中潜在病原体的相对丰度相似，可能因两者距离近，微生物（包括病原体）易转移。野生鱼被海基养殖场吸引，增加了微生物传播风险。虽然部分微生物属未被确认为病原体，但相关分类群可能促进入侵物种在宿主肠道定植。例如，野生和海笼养殖鱼中发光杆菌属占主导，且该属分离株含有抗生素抗性基因，其微生物遗传相似性需进一步研究。此外，黄杆菌属在海笼转水箱的亚洲鲈鱼个体中分布不同，影响了通过粪便样本检测该菌的可行性，后续研究应关注其致病种类的检测。

β 多样性分析显示野生和海笼养殖鱼肠道微生物群存在相似性。养殖环境类型部分解释了肠道微生物群 β 多样性，农场和采样批次也有影响。不同农场的养殖实践差异（如饲料配方、抗生素使用、收获前饥饿时间）以及农场外变量（如季节变化引起的水温、盐度变化）会影响鱼类肠道微生物群。圈养鱼类，尤其是封闭环境中的鱼类，更易受批次效应影响。本研究样本量大，涵盖不同长度和不同农场的鱼，能减轻未记录的特定养殖实践对结果的影响，且研究结果呈现的普遍趋势表明采样工作的可靠性。肠道微生物群的空间和时间分布特征有助于阐明其组成、α 和 β 多样性的变化规律，强调了结合环境参数研究肠道微生物群的重要性。2. 肠道微生物群的时间和空间变化：PERMANOVA 结果表明，在养殖亚洲鲈鱼中，“肠道分段” 是微生物 β 多样性的主要驱动因素。在亚洲鲈鱼肠道中，脱硫杆菌门（sulfidogenic bacteria）的相对丰度沿肠道增加，该菌与鱼类饮食中牛磺酸的呼吸作用有关，牛磺酸常与初级胆汁酸结合。胆汁从胆囊释放到近端肠道，目前对脱硫杆菌门的研究有限，进一步表征该菌有助于了解其在亚洲鲈鱼肠道中的功能，监测其丰度可能为鱼类胆汁酸状态提供线索，因为鱼类胆汁酸常受鱼粉替代品影响。

在属水平上，胃微生物群中差异丰富的属最多，且多数属的丰度高于后肠。Brevinema是胃中唯一丰度低于后肠的差异丰富属，该菌在多种鱼类肠道中存在，是人类病原体，但在鱼类中可能参与蛋白质代谢，这可能解释其在后肠中的较高丰度。前肠和后肠间仅Brevinema的丰度存在差异，前、中、后肠之间相似性可能与缺乏物理分隔结构有关。幽门盲囊的囊状结构增加了肠道表面积，有利于营养吸收。与后肠相比，幽门盲囊有两个差异丰富的属，即未分类的变形菌属和Burkholderia - Caballeronia - Paraburkholderia。变形菌属可创造厌氧环境，部分Burkholderia - Caballeronia - Paraburkholderia物种能进行厌氧代谢，这表明幽门盲囊除增加表面积外，还为特定微生物提供适宜环境，促进营养物质消化。总体而言，亚洲鲈鱼肠道微生物群在空间上存在差异，强调了基于肠道分段分析微生物群的重要性，但还需更多研究确定微生物群在各肠道分段和不同生长阶段的生理作用，同时考虑各分段内容物数量的差异。

亚洲鲈鱼肠道微生物群也随年龄变化。其他鱼类研究表明，宿主肠道微生物群多样性随年龄降低，本研究中亚洲鲈鱼随年龄增长，差异丰富属的丰度降低。其中部分属包含对人类或其他动物有潜在致病性的物种，虽相对丰度降低不代表绝对丰度降低，但未来研究绝对丰度有助于了解宿主年龄与潜在病原体数量的关系。若亚洲鲈鱼肠道中潜在病原体的绝对丰度随年龄降低，对商业养殖和鱼类消费具有重要意义，如可针对幼鱼中更丰富的潜在病原体进行研究以提高鱼苗和幼鱼的存活率，同时减少食用大鱼时接触潜在病原体的风险。3. 四种养殖鱼类核心肠道微生物群的高度相似性：四种养殖鱼类肠道微生物群的 β 多样性存在宿主特异性差异，但核心微生物方面，四个共同核心 ASV 代表了亚洲鲈鱼和非亚洲鲈鱼养殖鱼类的大部分核心 ASV。这表明新加坡海域养殖鱼类的核心微生物群可能具有位置特异性，宿主特异性有限。中国的研究发现，不同地区养殖的鱼类肠道核心微生物群存在差异，表明位置对鱼类肠道核心微生物群有影响。在新加坡养殖的多种鱼类可能存在共同的核心微生物群，这些微生物群为鱼类在特定环境中生存提供重要功能。由于本研究基于 16S rRNA 基因 V4 区域序列鉴定 ASV，共享核心 ASV 可能属于不同微生物菌株。为确定新加坡养殖鱼类核心肠道微生物群的宿主特异性，需获取微生物基因组信息，同时了解更多养殖实践信息（如饲料类型），以全面了解影响鱼类肠道微生物群的因素。

结论

本研究对不同大小的野生和养殖亚洲鲈鱼肠道微生物群进行了广泛调查。总体而言，亚洲鲈鱼肠道微生物群存在空间和时间变化，外在因素（养殖环境类型）和内在因素（肠道分段和宿主年龄）对其有不同程度的影响。肠道分段中微生物的变化揭示了幽门盲囊的可能功能和宿主肠道中的氮循环。对特定微生物属分布和丰度的研究，有助于未来水产养殖应用，如针对潜在病原体治疗时靶向特定肠道分段或合理规划养殖环境类型。此外，新加坡养殖鱼类的肠道核心微生物群可能具有位置特异性，宿主特异性有限。进一步拓展到其他地理区域的研究以及代谢组学等 “组学” 分析，将有助于深入了解养殖亚洲鲈鱼微生物组的结构和功能，为水产养殖的可持续发展提供更有力的支持。