肠道微生物群与粪便 - 血清代谢模式紊乱：揭秘肺结核及合并 2 型糖尿病的潜在机制与诊断新线索

《Microbiology Spectrum 3.7》：Disorders of gut microbiota and fecal–serum metabolic patterns are associated with pulmonary tuberculosis and pulmonary tuberculosis comorbid type 2 diabetes mellitus

本文通过 16S rRNA 测序、非靶向代谢组学等技术，对肺结核（PTB）和 PTB 合并 2 型糖尿病（PTB - DM）患者展开研究。发现患者肠道微生物群 α、β 多样性降低，多种代谢途径改变。该研究为探索疾病诊断生物标志物提供依据，值得关注。

　　### 研究背景
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的慢性传染病，其中肺结核（PTB）最为常见。2021 年，全球估计有 640 万新的 TB 病例，约 140 万人死于 TB 相关疾病。2 型糖尿病（T2D）患者患 PTB 的风险比非糖尿病患者高 3.59 倍，且 PTB - DM 患者的症状更严重。目前，对 PTB - DM 和 PTB 的诊断主要依赖传统临床指标，难以早期预测疾病风险。同时，肠道微生物群在 PTB 和 T2D 的发生发展中均有重要作用，但糖尿病患者易患 PTB 的根本原因和机制尚未完全明确。因此，寻找更有效的生物标志物迫在眉睫。本研究采用 16S rRNA 测序、非靶向粪便代谢组学和血清代谢组学相结合的方法，对比 PTB 患者、PTB - DM 患者和健康个体的肠道微生物群和代谢组学特征，旨在探索关键诊断生物标志物，揭示相关分子机制。

研究方法

1. 临床样本采集：研究经杭州红十字医院伦理委员会批准，招募了 13 名健康志愿者（Health）、13 名 PTB 患者和 13 名 PTB - DM 患者。PTB 和 PTB - DM 患者均为新诊断病例，未接受过抗结核治疗，部分 PTB - DM 患者虽接受胰岛素治疗但血糖仍较高。健康志愿者生活方式正常，无不良习惯，近 1 年未使用抗生素。
2. 16S rDNA 测序：使用 OMEGA Serum/Stool DNA Kit 提取 DNA，设计 PCR 引物扩增 16S rDNA 基因的 V3 - V4 区域（464 bp），经 PCR 扩增、添加测序适配器和条形码、凝胶电泳验证、PCR 产物纯化后，在 Illumina MiSeq 平台测序，利用 FLASH 软件组装获得有效原始读数。
3. 差异微生物组分析：对原始读数进行质量过滤和去除嵌合体序列，使用 DADA2 进行去重和构建 ASV 特征表，计算相对丰度进行细菌分类分析。用 QIIME2 分析 α 和 β 多样性，在 R 语言中可视化。通过 LEfSe 分析确定分类生物标志物，利用 Blast 将 ASV 注释序列与 SILVA 数据库比对。采用随机森林分析构建预测模型并评估性能。
4. 非靶向代谢组学：将冷冻的血清和粪便样本在冰上解冻，用 50%（v/v）甲醇缓冲液提取代谢物。经涡旋、室温孵育、冷冻过夜、离心后，取上清液用于 LC - MS 分析。采用 UPLC 系统和高分辨率串联质谱仪 Q - Exactive 在正负离子模式下检测代谢物，基于 KEGG 和 HMDB 等在线数据库进行生物信息学预处理。
5. 差异代谢物分析：对非靶向 LC - MS/MS 数据进行统计分析，包括 Student t 检验和 Benjamini - Hochberg 错误发现率（FDR）校正，使用 metaX 进行监督正交偏最小二乘法判别分析（OPLS - DA），计算变量重要性投影（VIP）值筛选重要代谢物特征。
6. 组学数据的去混杂分析：由于组学研究样本量有限，使用 metadeconfoundR 进行协变量去混杂分析，评估组学特征（差异属、差异粪便代谢物和差异血清代谢物）与个体健康状态（健康、PTB 或 PTB - DM）及其他变量（如 BMI、HbA₁c、血糖水平等）之间的相关性，采用非参数检验。
7. 统计分析：使用未配对 Student’s t 检验或单因素方差分析（ANOVA）及 Tukey 事后检验分析差异的统计学意义，P < 0.05 为有统计学意义，数据以均值 ± 标准误（GraphPad Prism 6）表示。

研究结果

1. PTB - DM 和 PTB 患者肠道微生物群组成严重紊乱：PTB 和 PTB - DM 患者的诊断指标阳性率显著高于健康组，PTB - DM 患者在发热时长、HbA₁c、血糖等方面表现更差。PTB 组肠道微生物群的 α 多样性指数较健康组降低，PTB - DM 组进一步降低且差异有统计学意义。主成分分析（PCA）显示 PTB - DM 患者的微生物群落组成差异最大，群落相似性分析表明三组间肠道微生物群组成差异显著，说明 PTB - DM 加剧了 PTB 引起的肠道微生物群失调。
2. PTB - DM 与 PTB 的微生物群组成不同：健康组、PTB 组和 PTB - DM 组中，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度不同，PTB - DM 组中放线菌门（Actinobacteria）丰度显著升高，PTB - DM 组的Firmicutes/Bacteroidetes比值显著高于健康组和 PTB 组。在目水平，PTB 和 PTB - DM 患者中梭菌目（Clostridiales）和双歧杆菌目（Bifidobacteriales）生长受抑制，PTB 组中乳杆菌目（Lactobacillales）和丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）升高。在科水平，PTB - DM 患者中瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）受特异性抑制，PTB 和 PTB - DM 患者均抑制梭菌科（Clostridiaceae）生长，PTB 组中普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）丰度显著降低，PTB - DM 组中脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和梭杆菌科（Fusobacteriaceae）丰度有独特变化。
3. 鉴定出差异微生物生物标志物：通过 LEfSe 分析，健康组中优杆菌属（Eubacterium）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）等 20 个分类群丰富；PTB 组中g_Faecalibacterium、g_Blautia等分类群最优富集；PTB - DM 组中Lactobacillales、Bacilli等分类群更丰富。随机森林分析显示，LEfSe 分析确定的重要属与预测准确性和 Gini 指数相关，但前 20 个属预测宿主状态的准确性不理想。
4. PTB 和 PTB - DM 患者粪便代谢组发生改变：PCA 和 OPLS - DA 模型显示，健康组、PTB 组和 PTB - DM 组的粪便代谢组存在显著差异。PTB 组与健康组相比，2403 种代谢物显著上调，1422 种显著下调；PTB - DM 组与健康组相比，2387 种代谢物显著上调，1944 种显著下调，且 PTB - DM 组下调的代谢物更多。差异代谢物主要集中在脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物等类别。PTB 组与健康组有 77 种差异表达代谢物，PTB - DM 组与健康组有 100 种，PTB - DM 组与 PTB 组有 54 种。
5. 粪便代谢组学的 KEGG 代谢途径分析：PTB 组与健康组之间有 33 条潜在途径受调节，PTB - DM 组与健康组之间有 22 条途径富集。两组共享的途径包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢等。PTB 组特有的途径主要是氨基酸代谢，PTB - DM 组特有的途径包括赖氨酸降解、酪氨酸代谢等。PTB - DM 组与 PTB 组之间有 16 条途径富集，共享途径有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等，PTB - DM 组特有的途径包括精氨酸代谢、赖氨酸降解等。
6. 血清代谢组学分析：PCA 和 OPLS - DA 分析显示，健康组、PTB 组和 PTB - DM 组的血清代谢物存在差异，但 PTB - DM 组和 PTB 组之间差异较小。PTB 组与健康组相比，173 种代谢物上调，176 种下调；PTB - DM 组与健康组相比，157 种代谢物上调，375 种下调；PTB - DM 组与 PTB 组相比，34 种代谢物上调，76 种下调。血清代谢组中鉴定出的差异代谢物比粪便代谢组少。
7. 血清代谢组学的 KEGG 代谢途径分析：PTB 组与健康组之间有 D - 谷氨酰胺和 D - 谷氨酸代谢等途径，PTB - DM 组与健康组之间有酮体的合成和降解等途径。两组共享的途径包括鞘脂信号通路、癌症中的胆碱代谢等。PTB 组特有的途径有精氨酸生物合成、组氨酸代谢等，PTB - DM 组特有的途径有癌症相关途径、苯丙氨酸代谢等。PTB - DM 组与 PTB 组之间富集的途径较少，共享代谢途径有初级胆汁酸生物合成等，PTB - DM 组特有的途径有苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢等。
8. 组学特征与临床变量的去混杂分析及组学特征之间的相关性分析：去混杂分析表明，差异属与临床参数的关联受 HbA₁c、血糖和高密度脂蛋白水平的混杂影响。PTB - DM 状态和血糖对粪便代谢组的影响比血清代谢组更一致。相关性分析发现，肠道微生物群与粪便代谢物的相关性比与血清代谢物更紧密，17 个属与粪便差异代谢物显著相关，15 个属与血清差异代谢物显著相关。
9. 肠道微生物、粪便代谢物和血清代谢物之间的相关性：PTB 和 PTB - DM 均下调g_Roseburia、g_Ruminococcaceae_UCG.013等属，g_Paraprevotella在 PTB 中特异性富集但无统计学意义，g_Faecalibacterium等在 PTB - DM 中特异性富集。PTB 和 PTB - DM 共享的粪便代谢途径包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等，共享的差异表达代谢物主要是氨基酸。PTB 和 PTB - DM 组共享的血清代谢物只有三甲胺 N - 氧化物、脱氧胆酸和吲哚 - 3 - 丙酸，且未发现共享代谢途径。
10. 微生物生物标志物与差异粪便代谢物的相关性：PTB 和 PTB - DM 患者中，一些属的下调可能导致氨基酸减少，PTB - DM 患者中这些属和代谢物的下调更明显，表明糖尿病加重了 PTB 患者的肠道微生物群紊乱。共享的粪便微生物生物标志物和代谢途径可能作为预测糖尿病患者患 PTB 风险的诊断生物标志物，但基于属水平的样本分组未能有效区分 PTB - DM 和 PTB。
11. 微生物生物标志物与差异血清代谢物的相关性：PTB 和 PTB - DM 患者中三甲胺 N - 氧化物（TMAO）是共享的调节差异代谢物，其产生可能与共享属的减少有关。PTB - DM 患者的特定血清代谢物，如胆固醇，可能与 PTB - DM 患者中特异性调节的属有关，胆固醇、胆酸、丙酮和吲哚 - 3 - 乙酸可能是 PTB - DM 患者的潜在生物标志物。

讨论

本研究揭示了 PTB 和 PTB - DM 患者肠道微生物群、粪便代谢物和血清代谢物的特征。PTB 和 PTB - DM 患者肠道微生物群 α 多样性降低，Firmicutes门等多个分类群发生变化，氨基酸代谢等多条代谢途径改变。但本研究存在局限性，如肠道微生物群与粪便代谢物的具体关系需进一步验证，微生物群和代谢物作为生物标志物缺乏足够临床证据，临床样本数量较少等。未来需开展更多研究加以完善。

结论

综合 16S rDNA 测序、非靶向代谢组学分析及肠道微生物群与代谢物的相关性分析，PTB 和 PTB - DM 患者的肠道微生物群组成和代谢谱均出现紊乱。研究发现了 PTB 和 PTB - DM 患者中共享的属减少，主要属于Firmicutes门，以及氨基酸如甘氨酸、丝氨酸和组氨酸的显著调节。该研究有助于探索 PTB 和 PTB 合并糖尿病的关键诊断生物标志物，拓展了对肠道微生物群、代谢物与疾病关系的理解。