新型隐曲霉物种的致病性研究：差异毒力与抗真菌药敏性的新发现

本文利用大蜡螟（Galleria mellonella）模型评估曲霉属（Aspergillus）Terrei 组物种毒力，发现隐曲霉物种毒力和抗真菌药敏性存在差异。

　　### 新型隐曲霉物种的致病性研究：差异毒力与抗真菌药敏性的新发现
侵袭性曲霉病（Invasive aspergillosis，IA）是一种严重威胁免疫功能低下患者生命健康的临床真菌感染疾病，其高发病率和死亡率给医疗系统带来了沉重负担。曲霉属（Aspergillus）作为一类广泛存在的腐生真菌，其中部分物种具有致病潜力，能够突破人体宿主防御机制，引发一系列复杂的感染性疾病。传统观念中，人类曲霉病主要由少数曲霉物种引起，烟曲霉（A. fumigatus）最为常见，然而近年来随着真菌流行病学的动态变化以及分子技术的不断进步，一些此前未被充分认识的隐曲霉物种逐渐进入人们的视野，其在临床感染中的作用日益凸显。

在曲霉属的 Terrei 组中，目前已确认存在 25 个物种，它们被划分为 Terrei、Nivei 和 Ambigui 三个系列（主要系统发育分支）。其中，土曲霉（A. terreus sensu stricto，s.s.）是该组中最常从临床样本中分离出的物种之一，但许多其他物种，尤其是隐曲霉物种，由于受到数据库物种鉴定不准确、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF）文库不完整以及临床微生物实验室过度依赖基于形态学的鉴定方法等因素的限制，常常被漏诊。这些隐曲霉物种在临床样本中的实际存在情况远比我们想象的复杂，其对多种抗真菌药物的敏感性差异显著，这无疑给临床抗真菌治疗方案的选择带来了巨大挑战。

鉴于此，本研究聚焦于 Terrei 组中的 19 个物种，旨在通过生存分析和组织学检查，深入刻画这些物种的毒力特征，并精准测定它们在体外对抗真菌药物的敏感性模式。研究团队选取的 19 个物种大多为模式菌株，由荷兰乌得勒支的 Westerdijk 真菌生物多样性研究所的 CBS 生物库提供。在开展实验前，研究人员首先依据既定方法对菌株进行了精准鉴定，随后将冷冻保存于 - 80°C、10% 甘油中的菌株在麦芽提取物琼脂上 37°C 培养长达 5 天，为后续实验做好充分准备。

在抗真菌药敏试验环节，研究人员严格遵循欧盟抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）Def. 9.3.2 规定的肉汤微量稀释法，对两性霉素 B（Amphotericin B，AMB）、伏立康唑（Voriconazole，VRC）、泊沙康唑（Posaconazole，PSC）、艾沙康唑（Isavuconazole，ISA）、卡泊芬净（Caspofungin，CAS）和米卡芬净（Micafungin，MCF）这 6 种常用抗真菌药物进行了药敏测试。经过 48 小时的培养观察，仔细记录下每种药物的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC，针对 AMB、PSC、VRC 和 ISA，指观察不到菌丝生长的药物浓度）和最低有效浓度（Minimum Effective Concentration，MEC，针对棘白菌素类药物，指能显著改变菌丝生长且使菌落变钝的药物浓度），且每次测试均重复两次，选取最高值进行报告。实验结果显示，不同系列的曲霉物种对抗真菌药物的敏感性存在明显差异。Ambigui 系列对所有测试抗真菌药物均表现出最低的 MIC 范围，这或许与该系列物种数量较少有关；而 Nivei 系列相较于 Terrei 和 Ambigui 系列，唑类药物的 MIC 范围整体高出一个梯度，其中A. niveus的 VRC 和 ISA MIC 值最高，A. iranicus的 ISA MIC 值也较高，这与以往研究中隐曲霉物种对唑类药物敏感性降低的结论高度一致。

为深入探究 Terrei 组物种的毒力差异，研究人员巧妙地选用了大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫作为替代体内模型。实验前，精心挑选体重在 0.3 - 0.4g 的健康六龄大蜡螟幼虫，将其置于 15°C 黑暗环境中暂养。实验时，先将真菌菌株在麦芽提取物琼脂上 37°C 培养 5 天，随后通过 40μm 和 5μm 细胞滤网过滤孢子溶液，反复洗涤以去除菌丝和分生孢子梗，利用血细胞计数器精确计数后，将孢子悬浮液调整至浓度为 5×10⁸/mL 的昆虫生理盐水（Insect Physiological Saline，IPS）溶液。实验设置了未处理幼虫和注射 20μL 无菌 IPS 的幼虫作为对照组，每个测试组每次注射 20 只幼虫，在 37°C 黑暗环境中培养，每隔 24 小时密切监测幼虫的存活情况，持续观察 144 小时。实验独立重复三次，综合所有实验数据计算不同时间点的平均和中位存活率。

生存分析结果表明，Ambigui 系列与 Terrei 和 Nivei 系列的中位生存曲线存在显著差异（P < 0.0001），而 Terrei 和 Nivei 系列整体的中位生存曲线虽无明显差异，但进一步细致观察发现，许多物种在 72 小时时死亡率达到 100%。以 72 小时为关键参考时间点，研究人员发现各系列的中位生存曲线可清晰地划分为两个阶段，从而依据存活时间将物种分为高毒力（短存活，最长 72 小时）和低毒力（长存活，最长 144 小时）两组。在 Terrei 系列中，A. terreus、A. aureoterreus和A. pseudoterreus的毒力显著高于其他物种，而A. alabamensis、A. neoafricanus、A. hortae和A. montoensis的毒力则明显较低；在 Nivei 系列中，A. niveus和A. carneus的平均存活时间仅 72 小时，死亡率高达 100%，毒力最强，A. barbosae和A. allahabadii的死亡率分别为 39.1% 和 57.3%，平均存活时间为 144 小时，毒力相对较弱；Ambigui 系列的两个物种A. ambiguus和A. microcyticus毒力均较低，存活时间为 144 小时，死亡率分别为 57.3% 和 66.5%，且二者毒力差异不显著。

为进一步直观地了解真菌在宿主体内的感染过程和侵袭特性，研究人员同步开展了组织病理学研究。他们依据各物种的存活曲线，精心选择了合适的样本采集时间点：对于高毒力物种，在接种后 24 小时采集样本；对于低毒力物种，则在接种后 72 小时采集样本，确保幼虫组织在保持一定完整性的同时处于感染进展的关键阶段。采集后的幼虫经 100μL 10% 缓冲福尔马林（在磷酸盐缓冲盐水中）注射固定，整体在福尔马林中保存 10 天，随后进行石蜡包埋，纵向切成 5μm 厚的切片，采用 Grocott 六胺银（Grocott methenamine silver，GMS）染色，以便清晰地观察真菌元素。借助 3DHISTECH 的 CaseViewer 数字显微镜应用程序，研究人员对扫描后的组织学样本进行了详细分析，并拍摄了不同放大倍数的显微照片。

组织病理学结果有力地支持了生存分析的结论。在 Terrei 系列中，高毒力代表物种A. terreus在接种后 24 小时就出现了明显的扩散现象，而低毒力代表物种A. alabamensis在接种后 72 小时的组织分布较少；Nivei 系列中，高毒力的A. niveus在接种后 24 小时菌丝生长活跃，真菌元素几乎遍布幼虫全身，组织侵袭性极强，低毒力的A. barbosae在接种后 72 小时仅有少量菌丝形成，组织内仅见少数集中的分生孢子或短菌丝斑点；Ambigui 系列的两个物种在接种后 72 小时，虽真菌元素可分布于整个幼虫组织，但主要以分生孢子形式存在，丝状形式较少，组织侵袭性较低。

综合来看，本研究为曲霉属 Terrei 组物种的毒力特征提供了全新的认识视角。研究发现，不同系列的曲霉物种在毒力和抗真菌药敏性方面存在显著差异，部分隐曲霉物种不仅具有高毒力，还对传统抗真菌药物表现出较低的敏感性。这一研究成果深刻揭示了准确鉴别隐曲霉物种的重要临床意义，为临床医生在面对曲霉感染时选择合适的抗真菌治疗方案提供了关键的理论依据。

然而，本研究也存在一定的局限性。一方面，每个物种所测试的菌株数量较少，大多仅涉及模式菌株，难以全面反映物种内部的潜在异质性，后续研究可纳入更多具有不同表型的菌株，从生态学角度深入探究环境分离株和临床分离株之间的差异；另一方面，本研究的组织学方法主要以定性分析为主，未来需要开展定量研究，精确测定体内真菌负荷、深入分析宿主免疫反应，从而更全面、深入地揭示曲霉属 Terrei 组物种的致病机制。

随着免疫功能低下人群的不断增加以及真菌耐药问题的日益严峻，深入了解曲霉属物种的致病机制和抗真菌药敏特性显得尤为重要。本研究作为该领域的重要探索，为后续进一步研究指明了方向，有望推动临床真菌病诊断和治疗技术的不断进步，为患者带来更多的希望。