MALDI-TOF MS 技术：双平台助力复杂微生物精准鉴定的国家实验室探索

《Microbiology Spectrum 3.7》：MALDI-TOF MS experience with the identification of complex microorganisms using two devices in a National Reference Laboratory

本文通过对比 VITEK MS PRIME 和 Microflex LT 两种基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）平台，评估其对复杂微生物的鉴定性能。研究发现两者各有优劣，整体鉴定符合率达 98.23%，为临床实验室选择合适平台提供重要参考。

　　

引言

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术在临床微生物学领域引发了一场变革。传统的微生物鉴定方法，如繁琐的表型检测和复杂的分子程序，耗时久且操作复杂。而 MALDI-TOF MS 技术凭借其独特优势，能在短短几分钟内得出可靠结果，大大缩短了诊断时间，在许多情况下逐渐取代了传统方法。

目前，市场上主要有两种商业化的 MALDI-TOF MS 平台，分别是德国布鲁克道尔顿公司（Bruker Daltonics Inc.）的 MALDI Biotyper（以 Microflex LT 为代表机型）和法国生物梅里埃公司（bioMérieux）的 VITEK MS（本文研究的是新一代 VITEK MS PRIME）。这两种系统虽然在硬件、软件、数据库以及样本制备和蛋白质提取方法上存在差异，但多项研究表明，它们在鉴定常见细菌方面都有着较高的性能。

在阿根廷，国家传染病研究所的国家参考实验室率先采用了 MALDI-TOF MS 技术。随后，为了更好地推广这一技术并确保其在各临床实验室的有效应用，于 2015 年成立了一个战略网络。该网络涵盖了所有通过不同商业平台将 MALDI-TOF MS 技术作为诊断工具的公共和私人实验室。在此背景下，本研究旨在对 Microflex LT 和 VITEK MS PRIME 这两个平台，基于更新的平台和数据库，进行大规模复杂临床相关微生物鉴定性能的严格平行比较评估。

材料和方法

研究人员从拉丁美洲文化收藏联合会的培养物收藏以及其他合作实验室获取了 882 株细菌分离株，并将其冷冻保存在含 10% 甘油的胰蛋白酶大豆肉汤中，储存温度为 -80°C。同时，在 6 个月内前瞻性地处理实验室日常样本，用于比较两个平台的性能。

依据细菌的分类学特征，研究人员将这些分离株划分为不同的科，如放线菌目（Actinomycetales）、气单胞菌属和弧菌属（Aeromonas and Vibrio）、苛养革兰氏阴性杆菌（Fastidious gram-negative bacilli）等。

鉴定细菌的金标准方法是多相分类法，包括根据临床和实验室标准协会（CLSI）MM18 标准指南，对不同科的组成基因进行扩增和测序，同时结合生化和血清学检测。对于 16S rRNA 基因，使用对应于大肠杆菌 16S rRNA 基因位置 8 - 27F（5′ - AGAGTTTGATYMTGGCTCAG - 3′）和 1492R（5′ - ACCTTGTTACGACTT - 3′）的引物进行测序和扩增。对于复杂分类群，则使用特定引物进行鉴定确认，如针对洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）复合体的 recA 基因、棒状杆菌属（Corynebacterium）物种的 rpoB 基因以及放线菌目分离株的 secA 基因等。

在 MALDI-TOF MS 平台操作方面，同一天由同一位操作人员对分离株进行操作。采用原位提取法，在样本处理上做了一些改进。对于 VITEK MS PRIME 平台，在一次性载玻片的每个点上加入 0.5 μL 的 100% 甲酸（FA），然后用经过实验室多年验证的木棒或后来购置的 VITEK PICKME 笔，采集处于指数生长期的单个菌落，与 FA 混合。待样本干燥后，立即或在每个采集组最多延迟一段时间后，覆盖 1 μL 的商用基质 α - 氰基 - 4 - 羟基肉桂酸（CHCA）。对于 MICROFLEX LT 平台，在钢板的每个点上加入 1 μL 的 100% FA，用实验室常规使用的木棒加入菌落，待干燥后，在 30 分钟内加入 CHCA。由于样本的多样性，为了标准化操作，所有分离株均使用 FA 进行接种，尽管这与制造商的建议有所不同。这是因为大多数临床细菌具有细胞壁，细胞壁的厚度及其他成分会影响 MALDI-TOF MS 的鉴定率，而添加 FA 等额外提取步骤可以提高鉴定效果。

数据库方面，采集的光谱通过模式匹配，使用 MBT Compass Explorer 布鲁克库 v.12 和生物梅里埃 IVD v3.2（这是研究时可获得的最新版本）的默认设置进行分析。对于 IVD 数据库中未鉴定（NI）的样本，再与 SARAMIS v4.17 数据库（研究用途，RUO 模式）中的超光谱和参考光谱进行比较，评估鉴定结果是否有所改进。MBT Compass 参考库 v12 涵盖 704 个微生物属的 4274 个物种，仅供研究使用，其软件模块提供多种复杂的生物信息学算法，用于光谱比较和统计数据解释，方便用户优化微生物分类过程，创建、修改和组织数据及内部库。IVD V3.2 知识库是生物梅里埃开发的用于体外诊断（IVD）的封闭分类单元数据库，由 15556 个菌株的 47204 个光谱创建而成，涵盖 1316 个物种（1095 种细菌和 221 种真菌）。SARAMIS KB V4.17（研究用途）是用于 RUO 的分类单元数据库，由 37043 个参考光谱和 4929 个超光谱组成，总共涵盖 2286 个分类群（包括细菌、分枝杆菌、丝状真菌、酵母和藻类），还允许用户创建超光谱和分析生物标志物峰。

在每次运行前，都要进行相应的校准程序，并且依据每个制造商的建议设定鉴定标准。对于 VITEK MS PRIME 平台，使用大肠杆菌 ATCC 8739 菌株进行校准，需在 35 ± 2°C 的有氧环境下，在血琼脂上培养 18 - 24 小时。根据测试样本数量，将菌株接种在目标载玻片的 xA1、xB1 或 xC1 位置（每个 16 点采集组一个校准点），用接种环取大肠杆菌 ATCC 8739 细胞点在校准位置，立即用移液器向每个校准点加入 1 μL 的 VITEK MS - CHCA 基质，待每个点完全干燥。对于 Microflex LT 平台，使用 BTS 细菌测试标准（布鲁克道尔顿公司）进行校准，该标准由标准菌株大肠杆菌 DH5 - α 的核糖体蛋白商业提取物，添加两种额外蛋白质（RNA 酶和肌红蛋白）组成，用于检测 3637 - 16952 Da 范围内的标准峰，每个峰的位置需在制造商推荐的公差范围内（参考 Flex control 3.4 用户手册，2011）。

鉴定标准方面，在 MICROFLEX LT 平台中，质谱得分值≥2.0 被视为高置信度鉴定；如果第一和第二匹配结果为不同物种但属于同一属，则视为低置信度鉴定；得分值在 1.7 - 1.99 之间被视为属水平鉴定；得分值 < 1.70 则报告为未鉴定（NI）。在 VITEK MS PRIME 平台中，光谱与数据库中参考物种的相似性置信值在 60 - 99.9% 之间被视为高置信度鉴定；当光谱与两个、三个或四个物种匹配程度相同时，鉴定被定义为低区分度；当数据库中无匹配或匹配物种超过四个时，报告为无鉴定结果，置信值较低。

结果

在蛋白质提取方法的选择上，直接样本点样虽然简单，但对于有细胞壁、黏液状或色素沉着菌落的细菌，鉴定率可能较低。原位提取法结合 FA 则较为简单，在大多数情况下能很好地分辨到物种水平，因此本研究采用了该方法并进行了一些小的改进。而传统的管提取法虽然适用于灭活高致病性细菌和创建文库，但操作复杂、耗时，且不同平台的协议不同，难以在两个 MS 系统中标准化，所以本研究未采用。

在样本处理工具方面，使用 VITEK PICKME 笔在 VITEK MS PRIME 载玻片上点样，不仅加快了工作速度，还能使沉积在孔中的生物量标准化，在所有鉴定中都取得了良好的效果，尤其适合经验不足的操作人员。

周转时间上，两个平台的样本板制备过程相似，但 MICROFLEX LT 平台获取最终结果的整体工作流程更短，仅需 2 - 3 分钟，而 VITEK MS PRIME 平台则需要 6 - 7 分钟。这是因为 MICROFLEX LT 平台的结果是逐个孔读取显示的，而 VITEK MS PRIME 平台要等整个象限分析完成后才显示结果。不过，VITEK MS PRIME 平台可以同时加载多达 16 个载玻片，这些载玻片可由不同操作人员或实验室制备，减少了其较长的响应时间，适合样本鉴定量较少但有多个并行工作站的实验室。此外，VITEK MS PRIME 平台还提供了优先处理紧急载玻片的选项，并且新版本支持自动微调。

试剂和校准物方面，布鲁克的 CHCA 基质和 BTS 校准物需要在有机溶剂（50% 乙腈 + 47.5% H₂O + 2.5% 三氟乙酸）中复溶，而 VITEK MS 系统的试剂是即用型的。在载玻片方面，研究时布鲁克只有可重复使用的 96 孔板，使用完后需用三氟乙酸进行清洗；生物梅里埃的载玻片是一次性的，每个载玻片包含三个采集组，每组 16 个点，共 48 个孔，但一旦采集组中有一个或多个孔被使用，剩余的空孔就不能再使用。校准物方面，商业冻干的 BTS 虽然有一些使用和储存要求，但相比 VITEK MS PRIME 使用的大肠杆菌标准菌株 ATCC 8739，操作更简便。不过，大肠杆菌菌株校准失败时，需要重新接种并重新采集该采集组的所有孔，这是 VITEK MS PRIME 校准过程中的一个较大局限。

全球鉴定结果显示，由于两个平台结果表达方式差异较大，对于当前分类学上应报告为组或复合体的物种，如嗜水气单胞菌复合体（Aeromonas caviae complex）、缓症链球菌组（Streptococcus mitis group）、阴沟肠杆菌复合体（Enterobacter cloacae complex）等，若文库返回的结果与之相符，则视为在物种水平上鉴定正确。VITEK MS PRIME 平台在物种 / 复合体或组水平的正确鉴定率为 91%，Microflex LT 平台为 87%；在属水平，VITEK MS PRIME 平台为 4%，Microflex LT 平台为 10%；未鉴定率方面，VITEK MS PRIME 平台为 5%，Microflex LT 平台为 3%。将两个平台在属和物种水平的正确鉴定结果综合计算，整体符合率达到 98.23%。如果将 VITEK MS PRIME 平台 IVD 数据库中的未鉴定样本与 RUO 数据库进行比较，未鉴定率可显著降低至 2.5%。

两个平台在约 10% 的案例中需要重新测试。VITEK MS PRIME 平台主要是由于大肠杆菌菌株校准失败和无鉴定结果导致重测；布鲁克平台则是因为得分值低和光谱质量差，峰值不足。值得注意的是，两个平台对低置信度鉴定的不良光谱都会进行重新测试，VITEK MS PRIME 平台在重测时使用了 PICKME PEN，最终结果都体现在研究中。在所有案例中均未出现错误鉴定，两个平台在物种水平上的分歧主要出现在牛链球菌组（Streptococcus bovis group）、豚鼠气单胞菌（A.caviae）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、木糖氧化无色杆菌组（Achromobacter xylosoxidans group）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia sp.）、潘多拉菌属（Pandoraea pnomenusa 和 Pandoraea sputorum）以及一些棒状杆菌属（Corynebacterium）物种，但在属水平上未检测到差异。

为了进一步分析结果，研究人员将评估的微生物分为以下几类：革兰氏阳性杆菌（Gram - positive bacilli，GPB），包括放线菌目（Actinomycetales）、产孢 GPB、非产孢 GPB 和棒状杆菌；非发酵革兰氏阴性杆菌（Non - fermenting gram - negative bacilli，NFGNB）；苛养革兰氏阴性杆菌；革兰氏阳性球菌（Gram - positive cocci，GPC），包括过氧化氢酶阴性和过氧化氢酶阳性的 GPC；发酵革兰氏阴性杆菌（Fermenters gram - negative bacilli，FGNB），包括气单胞菌属 / 弧菌属（Aeromonas/Vibrio）和肠杆菌目（Enterobacterales）。

在革兰氏阳性杆菌（214 株）中，对于放线菌目，VITEK MS PRIME 和 Microflex LT 平台分别鉴定了 70 株属于 11 个属 29 个物种的分离株。VITEK MS PRIME 平台在物种 / 复合体或组水平的正确鉴定率为 73%，Microflex LT 平台为 66%；属水平鉴定率分别为 11% 和 20%；未鉴定率分别为 16% 和 14%。VITEK MS PRIME 平台未能鉴定出 4 株 Schaalia sp. 中的 2 株，Nocardia pseudobrasiliensis 未被任何数据库识别，Nocardia wallacei 在 IVD 库中也未被鉴定出来，但在 SARAMIS RUO 库中鉴定有所改进。Microflex LT 平台在鉴定 Rhodococcus 属时，由于直接提取法无法获得足够峰值，未给出鉴定结果，且得分值低于 2.0 的情况较多，导致属水平鉴定数量增加。对于这类干燥粗糙菌落的细菌，研究人员建议在进行 MALDI - TOF 检测前，向细菌菌落添加一滴水，或尝试 Rocca 等人开发的内部提取方案。

对于产孢 GPB，29 株属于 8 个属 11 个物种的分离株在两个系统中进行了测试。两个平台在物种 / 复合体或组水平的正确鉴定率均为 83%，但在属水平和未鉴定率上存在差异。VITEK MS PRIME 平台未能鉴定出 Paenibacillus sp.，而布鲁克平台则能正确鉴定到属水平。此外，芽孢杆菌属（Bacillus）的分类发生了重要更新，布鲁克平台的商业库中体现了这些变化，如 Priestia、Alkalihalobacillus 和 Weizmannia 等新命名，但 VITEK MS PRIME 平台尚未体现。

非产孢 GPB 方面，55 株属于 12 个属 18 个物种的分离株接受了测试。VITEK MS PRIME 平台在物种 / 复合体或组水平的正确鉴定率为 93%，Microflex LT 平台为 89%；属水平鉴定率分别为 7% 和 9%；Microflex LT 平台有 1 例（2%）Rothia sp. 未鉴定出来。两个平台都能快速鉴定出一些在传统实验室难以鉴定的具有临床意义的微生物，如人皮杆菌（Dermabacter hominis）、迟钝颗粒链菌（Dolosigranulum pigrum）、红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusopathiae）、阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）和龋齿罗氏菌 / 黏滑罗氏菌（Rothia dentocariosa/mucilaginosa）。但在鉴定单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）时，VITEK MS PRIME 平台从未将其误鉴定为其他物种，而 Microflex LT 平台无法有效区分单核细胞增生李斯特菌和无害李斯特菌（Listeria innocua），不过对于 5 株无害李斯特菌，两个平台都能正确鉴定到物种水平。

棒状杆菌方面，60 株属于 20 个物种 / 组的分离株在两个系统中进行了测试。VITEK MS PRIME 平台在物种 / 复合体或组水平的正确鉴定率为 82%，Microflex LT 平台为 78%；属水平鉴定率分别为 5% 和 10%；未鉴定率分别为 13% 和 12%。VITEK MS PRIME 平台未能鉴定出 Corynebacterium riegelii（2 株）和 Corynebacterium variabile（2 株），大多数 Corynebacterium kroppenstedtii（4 株中的 3 株）也未被鉴定出来。Microflex LT 平台的 MBT COMPASS 库则未能鉴定出 Corynebacterium coyleae（2 株）和 Corynebacterium freneyi（2 株）。对于 Corynebacterium mucifaciens/ureicelerivorans 和 Corynebacterium propinquum/Corynebacterium pseudodiphtheriticum 的 10 株分离株，两个平台都仅给出了属水平鉴定，对于 C. variabile（2 株），两个平台都未给出可靠结果。

非发酵革兰氏阴性杆菌方面，225 株属于 30 个属 69 个物种 / 组的分离株进行了测试。VITEK MS PRIME 平台在物种 / 复合体或组水平的正确鉴定率为 90%，Microflex LT 平台为 84%；属水平鉴定率分别为 4% 和 14%；未鉴定率分别为 6% 和 2%。将 VITEK MS PRIME 平台 IVD 数据库中的未鉴定样本与 SARAMIS 数据库（RUO 模式）中的参考光谱和超光谱比较后，86% 的未鉴定样本得到了解决。两个平台都能正确鉴定出许多重要的机会致病菌，如产碱杆菌属（Alcaligenes）、伯格菌属（Bergey<