HIV-1 感染新发现：FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 如何影响树突状细胞防御

《Journal of Virology 4.0》：Impairment of endocytosis-related factors FNBP1L, ARHGAP24, and ATP6V1B1 increases HIV-1 entry into dendritic cells

本文揭示了 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 在限制 HIV-1 感染树突状细胞（DCs）中的作用及机制。

　　

一、引言

HIV-1 是一种严重危害人类健康的病毒，它主要感染 CD4⁺细胞，其中树突状细胞（DCs）作为免疫系统的 “前哨”，在黏膜表面巡逻，在性传播过程中常常率先接触到 HIV-1。DCs 作为专业的抗原呈递细胞（APCs），在启动免疫反应方面发挥着关键作用，然而它们与 HIV-1 的相互作用却十分复杂。

一方面，DCs 对 HIV-1 的 productive 感染具有一定的抵抗力，这主要归因于多种限制因子，比如 SAMHD1，它能够在感染早期阻断病毒复制。但另一方面，HIV-1 却能利用 DCs，使其捕获病毒粒子后迁移至淋巴组织，并将病毒传递给 CD4⁺T 细胞，从而促进病毒的传播。

由于 DCs 捕获病原体的功能与内吞作用和细胞骨架密切相关，而内吞作用在 HIV-1 感染 DCs 中的作用一直存在争议。不同的细胞模型研究结果显示，内吞作用对 HIV-1 感染 DCs 的重要性差异很大。因此，研究人员决定聚焦于参与内吞作用和细胞骨架相关的宿主因子，探究它们对 HIV-1 感染的影响，希望能为抗病毒策略提供新的潜在靶点。

二、研究结果

1. shRNA 敲低筛选相关因子为了有效敲低单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）中蛋白质的表达，研究人员利用了实验室开发的慢病毒 shRNA 转导方法，并结合能够降解 SAMHD1 的含 Vpx 病毒样颗粒（VLPs），使得 HIV-1 感染水平足以进行可靠的下游分析。通过靶向 CD4 受体的 shRNA 实验验证了该筛选方法的有效性，CD4 敲低显著抑制了 HIV-1 感染，且该抑制作用在病毒假型化为 VSV-G 包膜糖蛋白时被绕过，表明了 CD4 依赖的进入途径的特异性。

接着，研究人员基于文献筛选出可能参与 HIV-1 感染 MDDCs 的细胞骨架和内吞作用相关因子，并构建了一组商业化的 pLKO.1 shRNA 慢病毒载体。对多个供体的细胞进行转导实验后发现，除了 CD4，敲低 caveolin - 2（CAV2）也显著降低了感染，这与之前报道的 caveolae 作为 HIV-1 进入 MDDCs 的机制相符。此外，还有一些宿主因子的敲低会增强 HIV-1 感染，其中肌动蛋白细胞骨架调节剂 FNBP1L、ARHGAP24，以及液泡质子泵 ATP6V1B1 由于影响较大且此前未与 HIV-1 感染相关联，被优先选出来进行进一步研究。2. 验证相关因子对 HIV-1 感染的影响为了确认筛选结果，研究人员从更多供体获取 MDDCs，用靶向 FNBP1L、ARHGAP24 或 ATP6V1B1 的 shRNA 进行转导，确保转导效率接近 98% - 99%。实验结果表明，这些基因的敲低不会损害细胞活力、分化（通过 DC - SIGN 表达判断）和 CD4 蛋白表达。

在感染野生型、CCR5 嗜性的 HIV-1 时，敲低 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 显著增加了 eGFP 阳性细胞的比例，证实了它们在限制 HIV-1 感染中的作用。而当病毒假型化为 VSV-G 包膜时，虽然趋势相似，但感染增加的效果在不同供体中不显著，这表明这些宿主蛋白对病毒感染的影响是包膜依赖性的。

进一步在 THP1 细胞、Jurkat CD4 - CCR5 细胞和原代 CD4⁺T 细胞中进行研究发现，敲低这些因子在 THP1 细胞和 Jurkat 细胞中同样会增强 HIV-1 感染，但在原代 CD4⁺T 细胞中却没有这种效果，甚至出现相反作用，这暗示了不同细胞类型中肌动蛋白细胞骨架动力学存在差异。3. 探究相关因子对 HIV-1 进入 MDDCs 的影响鉴于研究的蛋白在细胞骨架组织和内吞作用中的作用，研究人员推测它们可能限制 HIV-1 进入 MDDCs。为此，他们采用了 BlaM - Vpr HIV 进入检测法，这是一种灵敏的定量病毒进入的方法。

实验结果显示，敲低 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 后，HIV-1 感染时的进入速率增加。无论是感染 CXCR4 嗜性还是 CCR5 嗜性的 HIV-1，敲低这些因子都一致导致病毒进入显著增加，这进一步证实了这些宿主蛋白在 HIV-1 进入 MDDCs 过程中起到限制作用。4. 研究相关因子敲低对 MDDCs 内吞活性的影响研究人员使用了两种功能性内吞实验来检测 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 敲低是否影响 MDDCs 的内吞作用。

在 FITC - 葡聚糖摄取实验中，敲低这些蛋白导致内吞活性降低，其中 FNBP1L 和 ARHGAP24 敲低对 FITC - 葡聚糖摄取的抑制作用尤为明显，而 ATP6V1B1 敲低的影响较小。在 pHrodo Escherichia coli生物颗粒吞噬实验中，敲低这些蛋白同样导致吞噬活性下降，特别是 ATP6V1B1 敲低显著降低了 pHrodo E. coli生物颗粒的摄取，这证实了敲低 ATP6V1B1 会导致细胞内酸化受损。用已知的内吞作用和细胞骨架抑制剂处理对照细胞，也得到了类似的结果，验证了实验的有效性。

三、讨论

研究结果表明，敲低 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 会增强 MDDCs 对 HIV-1 的感染，但在 CD4⁺T 细胞中却没有这种效果。这揭示了破坏膜环境和降低液泡酸化能够使病毒更有效地进入 MDDCs。

FNBP1L 通过调节肌动蛋白，参与膜变形、囊泡形成和运输等过程。它的缺失会损害细胞的一些重要功能，影响巨胞饮作用和受体介导的内吞作用，而这些过程都与 HIV-1 进入 DCs 有关。此外，FNBP1L 还控制丝状伪足的形成，丝状伪足有助于 HIV-1 从感染的树突状细胞传播，其可能通过与 Cdc42 和 N - WASP - WIP 复合物相互作用来发挥这些作用。

ARHGAP24 是 Rac1 的 GTP 酶激活蛋白（GAP），Rac1 是一种小 Rho GTP 酶，调节肌动蛋白聚合。ARHGAP24 的缺失会导致 Rac1 过度激活，引起过多的膜突起，干扰内吞作用，影响网格蛋白非依赖性内吞和巨胞饮作用。同时，ARF6 作为下游信号的协调者，与 ARHGAP24 共同调节 Rac1 活性，敲低 ARHGAP24 和 ARF6 会以不同方式影响 Rac1 活性，进而影响内吞过程和病毒进入。

ATP6V1B1 是 V - ATPase 的一个亚基，对液泡酸化和内体成熟至关重要。它的缺失会破坏内体酸化，虽然内吞作用仍能发生，但缺乏酸化会使内吞的 HIV-1 逃避降解，从而增强感染。

不同类型的免疫细胞在捕获和影响 HIV-1 传播方面能力相似，但由于受体表达和处理机制的差异，它们的作用有所不同。例如，朗格汉斯细胞（LCs）表达的 Langerin 能够捕获 HIV-1 并将其导向自噬降解途径，限制感染；而 DCs 表达的 DC - SIGN 则促进 HIV-1 感染和传播，使 HIV-1 逃避降解并转移到 CD4⁺T 细胞。

在本研究中，敲低 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 后，HIV-1 进入 MDDCs 的增强，表明这些因子通过靶向内吞的病毒进行后续的溶酶体降解来限制病毒进入。内吞作用实验显示，敲低这些因子破坏了液相内吞和吞噬作用，导致 FITC - 葡聚糖和 pHrodo E. coli生物颗粒的摄取减少。这可能改变了树突状细胞高度受控的膜环境，为 HIV-1 提供了一种替代的、限制较少的进入机制。

此外，本研究还发现，敲低这些宿主因子对 VSV - G 假型化的 HIV-1 感染没有增强作用，这突出了 VSV - G 和野生型 HIV-1 进入机制的差异。VSV 通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，主要依赖 LDL 受体，与肌动蛋白动力学关系不大；而 HIV-1 则更依赖肌动蛋白依赖的途径，如巨胞饮作用或小窝内吞作用，这进一步强调了肌动蛋白细胞骨架在调节 HIV-1 进入 DCs 中的重要作用。

敲低 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 在 CD4⁺T 细胞和 MDDCs 中的不同效果，也体现了 HIV-1 在不同细胞类型中偏好不同的进入途径。树突状细胞具有更密集的肌动蛋白细胞骨架和一些对 HIV-1 病毒包膜亲和力较高的表面分子，使得内吞作用成为 DCs 中重要的限制机制。

综上所述，本研究揭示了 FNBP1L、ARHGAP24 和 ATP6V1B1 在限制 HIV-1 进入 MDDCs 中的作用。它们可能通过 pH 依赖的内吞摄取、运输和降解病毒，以及维持细胞表面的高张力环境来调节细胞对异物的摄取。当这些因子受损时，HIV-1 的进入途径可能会转向更有效的融合途径。未来对这些因子调节病毒进入机制的进一步研究，将有助于深入理解 HIV-1 的发病机制，以及 DCs 与其他免疫细胞的差异，为开发新的抗病毒干预措施提供潜在的靶点。

四、材料与方法

1. 质粒研究中使用的 shRNA pLKO.1 - puro 质粒购自 Sigma Aldrich，其他多种质粒，如用于产生 HIV 病毒和相关实验的质粒，分别由不同的研究人员馈赠。
2. 单核细胞分离和慢病毒转导从健康供体的血沉棕黄层中分离单核细胞，将其培养为 MDDCs。慢病毒载体上清液按报道方法制备，在单核细胞分离后第 1 天进行慢病毒转导，转导过程中加入含 Vpx 的 VLP、polybrene 并进行离心接种。
3. Vpx - VLP 和 HIV 病毒的生产NL4 - 3 - Bal - IRES - eGFP 和 Vpx - VLP 通过转染 293T 细胞制备，VSV - G 假型化的 NL4.3 病毒生产方法类似。用于病毒进入检测的含 BlaM - Vpr 的 HIV 颗粒通过共转染多种质粒制备，病毒上清液经过处理和浓缩后储存，并通过测量病毒逆转录酶（RT）活性进行滴定。
4. HIV 感染和 MDDCs 的进入检测转导 6 天后的 MDDCs 进行 HIV 感染实验，感染后通过流式细胞术检测感染情况。HIV BlaM - Vpr 感染实验步骤类似，感染后进行染色和孵育，再进行分析。THP1 细胞、Jurkat CD4 - CCR5 细胞和 CD4⁺T 细胞也以类似方式感染和分析。
5. FITC - 葡聚糖和 pHrodo E. coli生物颗粒摄取实验FITC - 葡聚糖摄取实验中，MDDCs 与 FITC - 葡聚糖在不同温度下孵育，通过流式细胞仪测量平均荧光强度（MFI）评估摄取情况，并进行归一化处理。pHrodo E. coli生物颗粒摄取实验中，MDDCs 与 pHrodo Red E. coli生物颗粒孵育，利用 Incucyte 活细胞成像系统监测吞噬作用，通过软件计算平均红色积分强度反映颗粒摄取和酸化情况，并进行归一化处理。
6. 流式细胞术和免疫印迹通过流式细胞术分析表面 CD4 表达，免疫印迹用于检测蛋白表达水平，包括 FNBP1L、ARHGAP24 等，用相应抗体进行检测，并用 ImageJ 软件进行蛋白表达定量分析。
7. 定量实时 PCR使用定量实时 PCR（qPCR）测量 MDDCs 中ATP6V1B1基因的残留表达水平，以 YWHAZ 和 RPL13A 作为参考基因，用 qBase 软件计算ATP6V1B1相对表达量。
8. 统计分析使用 GraphPad Prism version 8.00 for Windows 进行非参数统计分析，根据实验情况选择合适的统计方法，如 Mann - Whitney U检验、Friedman 检验和 Kruskal - Wallis 检验等。}