HIV-1 RNA转录起始位点的异质性及其对病毒复制的影响

《Journal of Virology 4.0》：HIV-1 single-transcription start-site mutants display complementary replication functions that are restored by reversion

本研究揭示了HIV-1两种主要RNA转录起始位点（cap1G和cap3G）在病毒复制中的不同功能及其相互作用，为理解HIV-1复制机制提供了新见解。

　　HIV-1的复制依赖于其RNA的转录、包装、翻译和逆转录等过程，而这些过程与病毒RNA的转录起始位点密切相关。本研究深入探讨了HIV-1两种主要RNA转录起始位点的异质性及其对病毒复制的影响，揭示了不同转录起始位点产生的RNA在病毒生命周期中的不同功能和相互作用。

HIV-1的转录起始位点异质性 HIV-1的转录起始位点具有独特的异质性，主要在两个位置（cap1G和cap3G）启动转录，生成具有不同5′端的RNA。这两种RNA在病毒复制中的命运不同，cap1G RNA几乎被病毒颗粒完全包装，而cap3G RNA则主要保留在细胞内，并在多聚核糖体和剪接病毒RNA中富集。研究者通过构建病毒启动子突变体，分别产生单一RNA 5′异构体或两者组合，研究了它们在细胞中的复制特性。

单一转录起始位点RNA的功能 研究发现，当细胞中仅存在单一形式的RNA时，cap1G RNA和cap3G RNA均可作为mRNA和基因组RNA（gRNA）。然而，cap3G RNA在翻译和剪接方面更为高效，而cap1G RNA在包装到新生病毒颗粒中的能力上略优于亲本病毒产生的RNA。当两种RNA分别从不同载体共表达时，cap1G RNA优先被包装到病毒颗粒中。

在传播感染过程中，仅表达cap1G的病毒表现出轻微的复制缺陷，而仅表达cap3G的病毒在高度易感的MT-4细胞系和原代人CD4+ T细胞中均显示出严重的复制延迟。经过传代后，cap3G-only病毒产生了回复突变体，其复制能力恢复到与双转录起始位点（cap1G+cap3G）的亲本病毒相当的水平。这些回复突变体恢复了多转录起始位点的使用，并且包装和剪接水平也得到了恢复。

RNA包装和翻译的差异 研究进一步探讨了两种RNA异构体在包装和翻译效率上的差异。通过RNase保护实验（RPA）和单病毒分析，发现cap1G-only RNA的包装效率比WT病毒高约1.2倍，而cap3G-only RNA的包装效率则降低了约1.6倍。这表明cap3G RNA的包装效率仅为cap1G RNA的一半左右。此外，cap3G-only病毒产生的Gag蛋白水平与WT相当，而cap1G-only病毒产生的Gag蛋白水平则较低，这与cap3G RNA在多聚核糖体上的富集和翻译效率较高相一致。

在竞争包装实验中，当cap1G RNA和cap3G RNA共表达时，cap1G RNA能够有效地阻止cap3G RNA的包装。这表明在自然感染中，cap1G RNA在病毒颗粒中的包装具有显著的优势。

传播感染中的复制动力学 在MT-4细胞和原代CD4+ T细胞中进行的传播感染实验显示，cap1G-only病毒的复制动力学与WT相似，但略有延迟，而cap3G-only病毒的复制则显著减缓，达到峰值的时间比WT或cap1G-only病毒晚2-5天。这进一步证实了cap3G-only病毒在包装和早期复制阶段存在缺陷。

回复突变体的出现和特性 在cap3G-only病毒的传播感染过程中，迅速出现了回复突变体，并逐渐在细胞培养中占据主导地位。这些回复突变体通过单核苷酸替换恢复了多个转录起始位点的使用，并且在包装和剪接水平上得到了显著改善。例如，cap3G-R2和cap3G-R3回复突变体在包装效率上显著优于cap3G-only病毒，并且其复制动力学与WT病毒相似。

这些回复突变体的出现表明，恢复多种RNA 5′异构体的产生对于病毒复制的成功至关重要。尽管这些回复突变体并未完全恢复WT的转录起始位点序列，但它们通过改变转录起始位点，优化了RNA的包装和剪接功能，从而提高了病毒的适应性。

结论 本研究深入揭示了HIV-1两种主要RNA转录起始位点的异质性及其在病毒复制中的不同功能。cap1G RNA和cap3G RNA在病毒生命周期中扮演着互补的角色，分别在包装和翻译/剪接方面具有优势。回复突变体的出现进一步证实了恢复多种RNA 5′异构体的重要性。这些发现不仅为理解HIV-1的复制机制提供了新的视角，还可能为开发抗HIV-1药物提供新的靶点。未来的研究可以进一步探索这些RNA异构体在不同宿主细胞环境中的功能差异，以及它们如何影响病毒的传播和致病性。