寨卡病毒 PrM 基因单突变解锁感染新机制：打破 AXL 依赖的 “枷锁”

《寨卡病毒 PrM 基因单突变决定人类神经细胞感染对 AXL 的依赖性》一文，通过 CRISPR/Cas9 全基因组筛选等实验，确定 AXL 是寨卡病毒（ZIKV）感染人胶质母细胞瘤细胞的关键宿主因子。发现 ZIKV 的 PrM 基因 H83R 突变可使其感染摆脱对 AXL 的依赖，为研究病毒感染机制提供新视角。

　　一、研究背景
寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是黄病毒科成员，通过蚊虫叮咬传播。其在 2015 年巴西爆发后引发关注，因为它能垂直传播，导致先天性出生缺陷，在成人中还可引发神经系统疾病。ZIKV 基因组为约 11kB 的正链 RNA，翻译后的多肽经切割产生 10 种病毒蛋白，其中结构蛋白参与病毒粒子形成，非结构蛋白负责 RNA 复制和对抗细胞抗病毒反应。

宿主因子在 ZIKV 生命周期和发病机制中起关键作用，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）受体家族，如 TAM（Tyro3、AXL 和 MerTK）和 TIM（T-cell Ig mucin）家族，被认为是 ZIKV 感染的潜在辅助因子，但它们的作用存在争议，且在不同细胞类型和感染模型中的表现不同。本研究旨在明确 AXL 在 ZIKV 感染人胶质母细胞瘤细胞中的作用，并探究相关机制。

二、研究结果

1. AXL 是 ZIKV 感染 SNB-19 细胞的重要宿主因子
   研究人员从 NCI-60 细胞系中筛选出对 ZIKV 和登革病毒（Dengue virus，DENV）感染敏感的 SNB-19 胶质母细胞瘤细胞系，进行 CRISPR/Cas9 全基因组筛选。结果显示，AXL 是存活细胞中富集度最高的 CRISPR 靶点。通过构建 AXL 基因敲除（knockout，KO）的 SNB-19 细胞系进行验证，发现 ZIKV 在 AXL KO 细胞中的感染显著降低，而 DENV 感染不受影响。同时，AXL KO 细胞对 Spondweni 病毒（Spondweni virus，SPONV）的感染也受到抑制，表明 SPONV 感染这些细胞也依赖 AXL。进一步检测发现，SNB-19 细胞不表达其他 TAM 成员（Tyro3 和 Mer）和 PS 受体 TIM-1，且 AXL KO 不会诱导这些受体的补偿性表达，说明 DENV 感染该细胞可能通过 PS 受体非依赖途径。
2. AXL 在 TAM 家族成员中独特介导 ZIKV 感染
   在 AXL KO 的 SNB-19 细胞中分别表达 WT AXL、激酶失活突变体（AXL N90G 和 AXL-KD）、Tyro 和 Mer，结果显示，只有重新表达 AXL 能显著挽救 ZIKV 感染，且激酶活性至关重要，而表达 Tyro 或 Mer 不能挽救感染，表明 AXL 是 TAM 家族中唯一能介导 ZIKV 感染这些胶质母细胞瘤细胞的成员。
3. AXL 依赖性与结构蛋白相关
   利用 ZIKV/DENV 嵌合病毒进行实验，发现 DENV 感染 AXL KO 和野生型（wild type，WT）SNB-19 细胞效率相近，而 ZIKV 在 AXL KO 细胞中的感染明显降低。嵌合病毒 CHV-I（含 DENV 的 prM/E 蛋白和 ZIKV 的其他部分）感染 AXL KO 细胞时，病毒蛋白减少程度较小；CHV-II（含 ZIKV 的 prM/E 蛋白和 DENV 的其他部分）在 AXL KO 细胞中的感染更接近 ZIKV 的感染表型，且感染效率与 prM/E 蛋白相关，表明 AXL 依赖性的病毒决定因素可能存在于黄病毒的结构蛋白中。
4. 筛选和鉴定 AXL 非依赖的 ZIKV 突变病毒
   虽然 ZIKV 在 AXL KO 细胞中的感染率低，但持续传代后获得了突变病毒 1ZS3，其在 AXL KO 细胞中的感染率远高于野生型病毒，在 WT 细胞中的感染效率与野生型相似。对 1ZS3 病毒进行测序，发现多个独立筛选出的抗性病毒中都存在 prM 基因的 H83R 突变，而在 WT 细胞中传代的病毒未出现该突变。在特定遗传背景下（ZIKV^FSS K265E）研究 H83R 突变的影响，结果显示，携带 H83R 突变的病毒在 AXL KO 细胞中的感染率和病毒滴度显著增加，表明该突变是 AXL 非依赖感染表型的原因，且该突变还使 SNB-19 细胞中的病毒滴度有一定增加。
5. H83R 突变影响病毒粒子结构但不影响 prM 切割和 IFN 信号通路
   由于 H83 靠近弗林蛋白酶（furin）切割位点，研究人员检测 prM 的切割模式，发现 WT 和 1ZS3 病毒无差异。有研究表明 AXL 通过抑制 IFN 信号通路促进 ZIKV 感染星形胶质细胞，然而在 SNB-19 细胞中，用 JAK 抑制剂（JAKi）或靶向干扰素 α 受体 1（IFNAR1）的小干扰 RNA（siRNA）处理，都不能挽救 AXL KO 细胞中的 ZIKV 感染，说明 AXL 介导 ZIKV 感染这些细胞的功能与 IFN 抑制机制无关，更可能与病毒粒子附着有关。通过冷冻电镜（cryoEM）对病毒粒子结构进行研究，发现从 Vero 细胞产生的 1ZS3 病毒粒子表面层混乱，无法获得收敛的重建模型；而从 C6/36 细胞产生的 1ZS3 病毒粒子结构与成熟的 WT ZIKV 基本相同。

三、研究讨论
本研究表明 AXL 是 ZIKV 感染胶质母细胞瘤细胞的重要宿主因子，prM 基因的 H83R 突变显著降低了对 AXL 的感染依赖。ZIKV 利用 AXL 感染 SNB-19 细胞的机制与先天免疫抑制无关，而与影响感染后续轮次附着的病毒粒子结构特征有关。

关于 PS 受体在黄病毒感染中的作用机制存在多种假说，AXL 与 Gas6 的结合在病毒进入过程中的具体作用仍不明确，且病毒粒子表面 PS 的可及性存在争议。本研究中不同 DENV 毒株与 ZIKV 毒株对 AXL 的依赖性不同，不受病毒生产来源影响。ZIKV 和 SPONV 中特有的第 83 位组氨酸残基可能与 AXL 依赖性有关，其突变为精氨酸后降低了这种依赖性，但突变对病毒粒子表面 PS 暴露或 AXL 结合水平的影响有待确定。

在 AXL KO 的 SNB-19 细胞中仍存在低水平的 ZIKV 感染，且呈剂量依赖性增加，这可能由其他替代机制介导，虽然排除了一些已知受体的作用，但其他潜在的进入因子如 C 型凝集素受体、整合素和表面唾液酸等，可能因突变而被 ZIKV 利用。

prM 的弗林蛋白酶切割对黄病毒成熟很重要，H83R 突变虽未影响 prM 切割，但可能影响 pH 依赖性的 pr 脱落，进而影响病毒粒子成熟过程中 M 和 E 的相互作用。该突变在 C6/36 细胞中对病毒粒子的影响不明显，可能与人和蚊子弗林蛋白酶样蛋白酶的活性差异或不同细胞中 pr 脱落的 pH 依赖性差异有关。此外，H83R 突变是曾用于提高疫苗株产量的突变之一，但其与 AXL 使用的关系尚未确定。

总之，本研究揭示了 ZIKV 病毒粒子装配过程中 prM 功能与子代病毒粒子进入附着过程中 PS 受体使用之间的联系，确定了 prM 上调节病毒粒子成熟的重要分子决定因素。未来对这些新联系进行更详细的生化和结构表征，将加深对黄病毒复制，尤其是装配、成熟和进入过程的理解。

四、研究方法

1. 细胞培养：人胶质母细胞瘤 SNB-19 细胞系在含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 培养基中，37°C、5% CO₂培养；埃及伊蚊 C6/36 细胞在含 10% FBS 的 Eagle's 最低必需培养基中，28°C、5% CO₂培养；Vero 细胞在含 10% FBS 和 1% 非必需氨基酸的 Dulbecco's 改良 Eagle's 培养基（DMEM）中，37°C、5% CO₂培养。
2. 病毒制备：ZIKV 和 DENV 在 C6/36 细胞中扩增，收集上清过滤、分装、冻存。质粒构建体转染细胞制备相应病毒，如 ZIKV FSS13025、DENV-2 D2Y98P 等，部分病毒在 Vero 细胞中扩增。
3. 感染和滴定：细胞接种后，按指定感染复数（MOI）加入病毒，孵育后更换新鲜培养基。采用焦点形成单位（FFU）法测定病毒滴度，通过一系列免疫反应进行检测。
4. 全基因组 CRISPR/Cas9 筛选：扩增 sgRNA 文库，转染 293T 细胞生产慢病毒，功能滴定后转导 SNB-19 细胞，经嘌呤霉素筛选和 ZIKV 感染，收获存活细胞进行后续分析，实验设两个生物学重复。
5. 基因组 DNA 提取、测序和数据分析：收集细胞沉淀，经一系列处理提取基因组 DNA，PCR 扩增后进行下一代测序，用 MAGeCK 工具分析候选基因靶点。
6. AXL CRISPR 敲除构建和验证：将靶向 AXL 的 sgRNA 构建体导入 SNB-19 细胞，筛选 AXL 阴性细胞克隆，通过 western blotting 和测序验证。构建表达 AXL 和其他 PS 受体的慢病毒载体，转导细胞后进行分选和突变工程。
7. 1ZS3 病毒的产生：AXL KO 的 SNB-19 细胞感染 ZIKV^PRV后连续传代，收集上清感染新的 AXL KO 细胞，重复多次获得 1ZS3 病毒，同时在 WT 细胞背景下进行平行传代。
8. 病毒 RNA 提取、cDNA 制备、测序和数据分析：提取 1ZS3 和 PRVS3 病毒的 RNA，制备 cDNA，扩增全基因组后进行 TOPO 克隆和 Sanger 测序。
9. western blotting：细胞直接裂解，经 SDS-PAGE 分离蛋白质，转膜后用相应抗体进行免疫印迹检测。
10. 免疫荧光：细胞固定、通透、封闭后，用抗黄病毒包膜抗体染色，再用荧光二抗染色，DAPI 复染后显微镜观察和 ImageJ 分析。
11. 流式细胞术分析：感染后的细胞经处理后，与相应抗体孵育，再用荧光二抗孵育，最后用 BD FACSCanto 机器检测，FlowJo 软件分析数据。
12. 小干扰 RNA 和 JAK 抑制剂实验：SNB-19 细胞转染 AXL 或 IFNAR1 的 siRNA 后感染病毒，JAKi 实验则在感染前加入 JAKi，24 h 后收集样本进行 western blot 分析。
13. 病毒纯化用于结构分析：病毒在 Vero 细胞中培养，经 PEG8000 沉淀、蔗糖梯度离心等步骤纯化，分析纯度。
14. 冷冻电镜：纯化病毒制备样本，在特定显微镜下收集数据，用 cryoSPARC 软件按标准流程处理数据。