HIV-1蛋白酶激活与逆转录酶稳定性及Gag-Pol二聚化关系的研究进展

《Journal of Virology 4.0》：A virus-like particle assembly system for probing the HIV-1 Gag–Pol dimerization domain: supporting evidence for reverse transcriptase involvement in protease activation by influencing Gag–Pol/Gag–Pol interaction

本研究揭示了HIV-1逆转录酶（RT）稳定性及二聚化对蛋白酶（PR）激活和Gag-Pol二聚化的影响，为HIV/AIDS治疗提供了新靶点。

　　本文深入探讨了HIV-1蛋白酶（PR）激活与逆转录酶（RT）稳定性及Gag-Pol二聚化之间的关系，揭示了RT在PR激活过程中的重要作用，并提出了Gag-Pol二聚化作为HIV/AIDS治疗新靶点的可能性。

引言 HIV-1是一种具有高度变异性和复杂生命周期的逆转录病毒，其复制和成熟过程依赖于多种病毒蛋白的相互作用。Gag基因编码的多聚蛋白是病毒样颗粒（VLP）组装和释放的关键，而Pol基因编码的蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和整合酶（IN）则在病毒复制中发挥重要作用。在HIV-1生命周期中，Gag-Pol融合蛋白的二聚化被认为能够触发PR的激活，进而通过蛋白水解作用促进病毒颗粒的成熟。然而，RT在Gag-Pol二聚化及PR激活过程中的具体作用尚不明确。本研究旨在通过一系列实验，揭示RT稳定性及二聚化对Gag-Pol二聚化和PR激活的影响。

RT稳定性对Gag-Pol病毒样颗粒组装效率的影响 研究者们发现，RT的稳定性对Gag-Pol病毒样颗粒（VLP）的组装效率具有显著影响。通过在Gagp6-Pol构建中引入RT亮氨酸重复序列（LRM）的氨基酸替换突变，发现这些突变导致RT的不稳定性增加，进而显著降低了VLP的组装效率。例如，LRM突变L283K、L289K等均表现出病毒相关p66/51RT的检测量减少，病毒颗粒处理效率降低。这表明LRM突变可能通过破坏Gag-Pol/Gag-Pol相互作用，阻碍PR激活，从而影响VLP的组装。

LRM突变对efavirenz（EFV）增强效应的拮抗作用 efavirenz（EFV）是一种非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI），具有体外增强RT二聚化的能力。研究发现，EFV能够增强Gagp6-Pol VLP的组装效率，但LRM突变则显著削弱了EFV的这种增强效应。这表明LRM突变可能通过降低RT的稳定性或二聚化能力，进而抑制Gag-Pol/Gag-Pol的相互作用，从而拮抗EFV对VLP组装的促进作用。

p6gag结构域对HIV-1 Pol VLP组装的影响 p6gag结构域在Gagp6-Pol VLP组装中发挥重要作用。研究者们构建了缺失大部分Gag编码序列但保留N端肌醇化序列和p6gag出芽结构域的p6-Pol构建。结果显示，p6-Pol能够在细胞中表达并释放出VLP，尽管其产量较Gagp6-Pol有所降低。这表明p6gag的存在对于HIV-1 Pol VLP的组装和释放是必需的，即使在缺乏主要Gag组装结构域的情况下。

Gag或p51RT结构域完整性对Gagp6-Pol VLP组装的重要性 研究还发现，Gag或p51RT结构域的完整性对于Gagp6-Pol VLP的高效组装至关重要。通过构建一系列C末端Pol截短突变体，发现保留完整p51RT结构域的Gagp6-Pol截短突变体能够高效组装VLP，而缺失p51RT结构域的Gagp6-3467T突变体则几乎无法组装VLP。这表明p51RT结构域在Gag-Pol二聚化及PR激活过程中发挥关键作用。

p6-RT VLP组装特性 p6-RT是一种仅包含p6gag和RT的最小构建，能够组装并释放VLP。通过蔗糖密度梯度分析和电子显微镜观察，发现p6-RT VLP的密度较低，颗粒尺寸较小，与野生型Gag颗粒相比存在显著差异。此外，通过RT-PCR检测发现p6-RT VLP能够包装病毒RNA，尽管其包装效率可能受到一定影响。

RT氨基酸突变对p6-Pol VLP组装的影响 研究还探讨了RT氨基酸突变对p6-Pol VLP组装的影响。结果显示，LRM突变L283K和L289K显著降低了p6-Pol、p6-PRRTIN和p6-RTIN的VLP组装效率，但在p6-RT中未观察到显著影响。这表明LRM突变对Gag-Pol/Gag-Pol相互作用的影响可能依赖于IN的存在。

结论 本研究通过一系列实验揭示了RT稳定性及二聚化对Gag-Pol二聚化和PR激活的重要作用。LRM突变导致的RT不稳定性能够显著降低Gag-Pol VLP的组装效率，并拮抗EFV的增强效应。此外，p6gag和p51RT结构域的完整性对于Gagp6-Pol VLP的高效组装至关重要。这些发现不仅增进了我们对HIV-1生命周期中关键步骤的理解，还为开发针对Gag-Pol二聚化的新型HIV/AIDS治疗策略提供了理论依据。未来的研究可以进一步探索Gag-Pol二聚化的分子机制，并基于此开发有效的抗HIV药物。