噬菌体卫星病毒（Sputnik）如何影响巨型病毒转录组：关键机制与三方系统互作探秘

《Journal of Virology 4.0》：Sputnik virophage disrupts the transcriptional regulation of its host giant virus

本文通过对感染相关病毒的变形虫进行转录组分析，揭示了噬菌体卫星病毒（Sputnik）对巨型病毒转录的影响机制。

　　### 噬菌体卫星病毒（Sputnik）对巨型病毒转录组的影响研究
噬菌体卫星病毒（Sputnik）是一类特殊的双链 DNA（dsDNA）病毒，它只能在被巨型 dsDNA 病毒 —— 拟菌病毒（mimiviruses）感染的宿主变形虫内复制。尽管 Sputnik 感染会影响拟菌病毒的复制，但其分子层面的相互作用却一直未被完全了解。本研究通过对感染不同病毒的棘变形虫（Acanthamoeba castellanii）进行时间进程转录组分析，深入探究了 Sputnik 与拟菌病毒之间的关系，为理解这一独特三方系统的分子互作提供了重要线索。

研究背景

噬菌体卫星病毒（Virophages）是与其他 dsDNA 病毒（核质大 DNA 病毒，nucleocytoviruses）相关联的小型 dsDNA 病毒，这些核质大 DNA 病毒通常具有大基因组和大颗粒，常被称为巨型病毒。首个被发现的噬菌体卫星病毒 Sputnik，其基因组为 18 kbp，存在于 80 nm 的颗粒中，它与基因组达 1.2 Mbp、颗粒大小为 700 nm 的拟菌病毒相关联。Sputnik 和拟菌病毒都能感染自由生活的棘变形虫属（Acanthamoeba）变形虫，但 Sputnik 只有在拟菌病毒感染的情况下才能复制。此外，Sputnik 感染会降低子代拟菌病毒的感染性，这也使得它被定义为 “寄生在其他病毒上的病毒”，即噬菌体卫星病毒。

在 Sputnik 被发现之后，人们又陆续分离出了多种与拟菌病毒及其他核质大 DNA 病毒相关的噬菌体卫星病毒，如与 Cafeteria roenbergensis 病毒（CroV）相关的 Mavirus，以及与 Phaeocystis globosa 病毒 - 14T（PgV - 14T）相关的 Gezel - 14T。不仅如此，在各种环境宏基因组数据中也鉴定出了噬菌体卫星病毒相关序列，其分布范围从水生环境到动物肠道瘤胃。虽然众多噬菌体卫星病毒被发现，且它们大多会影响宿主核质大 DNA 病毒的复制，但噬菌体卫星病毒与宿主核质大 DNA 病毒之间的相互作用因组合不同而各异，且这些微生物真核生物 - 巨型病毒 - 噬菌体卫星病毒相互作用的分子机制在很大程度上仍是未知的。

实验设计

由于 Sputnik 的感染周期尚未完全明晰，研究人员首先依据标记基因的表达时间来确定 RNA 测序的时间点。这些标记基因包括拟菌病毒的 DNA 聚合酶 B（polB）基因，以及拟菌病毒和 Sputnik 的主要衣壳蛋白（mcp）基因。结果显示，拟菌病毒polB基因的表达在感染后 3 小时（hpi）达到峰值，拟菌病毒mcp基因的表达在 6 hpi 达到峰值并持续到 9 hpi，Sputnik 的mcp基因表达模式与拟菌病毒mcp基因相似。在 12 hpi 时，polB基因表达再次上升，mcp基因表达下降，这表明第一个感染周期结束，第二个感染周期开始。基于这些结果，研究人员在 0、3、6 和 9 hpi 时，分别对仅感染拟菌病毒的变形虫细胞（Sputnik^?细胞）和同时感染拟菌病毒与 Sputnik 的变形虫细胞（Sputnik⁺细胞）进行转录组分析。

实验结果

1. 转录组图谱：在整个感染过程中，两种感染条件下变形虫来源的读数比例均下降，而病毒来源的读数比例上升。在 Sputnik^?细胞中，拟菌病毒来源的读数比例在 9 hpi 时达到约 50%；在 Sputnik⁺细胞中，9 hpi 时拟菌病毒和 Sputnik 的读数各占总读数的约 20%，两种细胞中病毒读数的总比例相似。
2. Sputnik 基因表达分组：研究人员发现 Sputnik 基因在 0 hpi 时映射的读数极少，因此认为此时的基因表达可能是假象。对 3、6 和 9 hpi 时 Sputnik 基因表达的研究表明，Sputnik 基因可根据表达模式分为两组。第一组为早期基因（5 个），在 3 hpi 时表达量高，从 6 hpi 到 9 hpi 逐渐下降；第二组为晚期基因（17 个），在 3 hpi 时表达量低，6 hpi 时表达量增加，并维持到 9 hpi。早期基因包含一个注释为 DNA 复制功能的基因，晚期基因则包含如 DNA 包装蛋白、膜蛋白和衣壳蛋白等与病毒粒子相关的基因。
3. Sputnik 对拟菌病毒感染后期的影响：基于拟菌病毒基因表达的主成分分析（PCA）显示，在 0 和 3 hpi 时，Sputnik^?和 Sputnik⁺细胞的样本位置接近，表明早期两者的转录谱相似。然而，在 6 和 9 hpi 时，两者样本明显分离。在 979 个分析的拟菌病毒基因中，这两个时间点分别有 412（42%）和 402（41%）个基因差异表达。而且，Sputnik⁺细胞在 9 hpi 时的样本与 Sputnik^?细胞在 6 hpi 时的样本在 PCA 中重叠，这表明 Sputnik 感染抑制了拟菌病毒基因表达的进程。
4. Sputnik 对变形虫基因表达的影响：基于变形虫基因表达的 PCA 分析显示，Sputnik^?和 Sputnik⁺细胞在每个时间点的样本都很接近。0 和 3 hpi 时没有变形虫基因差异表达，6 和 9 hpi 时分别只有 90（0.6%）和 98（0.7%）个变形虫基因差异表达，与拟菌病毒感染导致的变形虫基因表达变化数量相比，这些数字相对较小，说明 Sputnik 感染对变形虫基因表达影响较小。
5. Sputnik 对拟菌病毒基因表达时间的影响：研究人员根据拟菌病毒基因在 Sputnik^?细胞中的表达模式，将其分为立即早期、早期、中期和晚期四个簇。对 Sputnik⁺细胞样本应用相同的聚类方法后发现，大多数基因聚类到相似的簇中，但部分基因被归类到对应表达时间更晚的簇中，这与 PCA 中观察到的拟菌病毒基因表达延迟一致。进一步分析发现，Sputnik 感染会延长拟菌病毒立即早期和早期基因的表达，同时延迟中期和晚期基因的表达。
6. 拟菌病毒转录相关基因与 Sputnik 转录的关系：拟菌病毒编码复杂的转录机制，研究人员对 34 个具有转录相关注释的拟菌病毒基因进行研究。结果发现，这些转录相关基因大多被归类为早期和中期基因，在 3 hpi 时就已表达，早于 Sputnik 大量转录（即晚期基因表达）的起始时间。在感染后期（6 和 9 hpi），这些基因在 Sputnik⁺细胞中的表达更高，类似于其他表达延长的早期和中期基因。此外，还鉴定出了被归类为立即早期基因的可能的胞苷脱氨酶和可能的同源盒蛋白，这意味着这些基因可能参与了 Sputnik 早期基因的表达。
7. 启动子分析：先前研究在一些 Sputnik 基因的上游区域鉴定出了拟菌病毒基因的早期（AAAATTGA）和晚期（富含 AT 元件）启动子。在本研究中，研究人员发现 Sputnik 的早期基因和晚期基因中，部分基因含有这些启动子，这表明 Sputnik 至少部分地利用了拟菌病毒的启动子进行基因表达。虽然 Sputnik 感染会破坏含有晚期启动子的拟菌病毒基因的表达，但这些基因的表达模式与不含晚期启动子的差异表达基因相似，说明 Sputnik 对晚期启动子的利用对拟菌病毒基因差异表达的影响较小。此外，研究人员还对拟菌病毒差异表达基因的上游区域进行搜索，未发现其他特异性启动子基序，对 Sputnik 基因簇的搜索也未发现具有统计学意义的基序。

研究结论

本研究通过对感染拟菌病毒和 Sputnik 的变形虫进行转录组分析，发现 Sputnik 感染会在感染后期显著改变拟菌病毒的基因表达模式。Sputnik 感染不仅延迟了拟菌病毒中期和晚期基因的表达，还延长了立即早期和早期基因的表达，这可能阻碍了拟菌病毒从感染早期向晚期的转变，进而破坏了拟菌病毒晚期基因的表达。同时，研究表明 Sputnik 感染对变形虫的转录组影响较小，拟菌病毒是 Sputnik 的主要宿主，这支持了噬菌体卫星病毒的原始概念。虽然先前研究认为 Sputnik 与拟菌病毒共享启动子可能是其利用拟菌病毒转录机制的一种潜在方式，但本研究发现共享启动子并非拟菌病毒基因转录变化的主要机制，Sputnik 可能劫持了特定的转录机制来精确操纵拟菌病毒基因，但具体的候选基因尚未确定。未来的研究有望进一步揭示这一复杂三方系统的分子机制。