欧洲SARS-CoV-2分子诊断能力的持续提升：基于三次外部质量评估（EQA）的分析

《Journal of Clinical Microbiology》：External quality assessment of molecular detection and variant typing of SARS-CoV-2 in European expert laboratories in 2023

本研究通过三次外部质量评估（EQA）揭示欧洲实验室在SARS-CoV-2分子诊断及变异株鉴定能力上的显著进步，为全球抗疫提供重要参考。

　　

摘要

新冠疫情凸显了实验室准备的重要性。通过外部质量评估（EQA）定期监测诊断工具是维持强大公共卫生响应服务的关键。本研究开展了第三次针对欧洲专家公共卫生实验室的SARS-CoV-2 EQA，评估其诊断能力。研究制备并验证了一个包含10个样本的面板，涵盖Alpha、BA.4、BA.5、BQ.1.18变异株以及人类季节性冠状病毒和阴性对照。欧洲疾病预防与控制中心（ECDC）邀请了31个欧洲国家的38个实验室参与，要求其提交结果和检测细节。结果显示，大多数（32个，84%）实验室正确识别了所有样本，且使用商业试剂盒的比例逐渐增加。与前两次EQA相比，正确检测SARS-CoV-2样本的比例显著提高，从2020年的12%增加到2023年的90%。尽管参与实验室数量减少，但欧洲的SARS-CoV-2分子诊断能力显著提升，定期EQA对于维持快速公共卫生实验室响应系统至关重要。

研究背景

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行凸显了实验室准备的重要性以及维持强大诊断和响应服务的必要性。通过开展外部质量评估（EQA），定期监测病原体的分子检测和特征分析能力，是快速、准确检测病原体并监测其演变（变异监测）的关键。此前在2020年和2021年进行的两次欧洲SARS-CoV-2 EQA显示，诊断灵敏度有所提高，但仍存在低RNA浓度样本的检测问题。本研究旨在通过后续EQA再次评估欧洲专家实验室的表现，包括对最近流行的毒株的检测能力。

材料与方法

参与者

欧洲疾病预防与控制中心（ECDC）委托AURORAE联盟实施本次EQA，并邀请欧洲COVID-19参考实验室网络（ECOVID-LabNet）的操作联系点在2023年3月底前注册。目标是纳入所有参与COVID-19应对的国家参考实验室或类似实验室。

样本组成

EQA样本包含10个样本：7个含有不同SARS-CoV-2谱系（Alpha变异株B.1.1.7和Omicron变异株BA.4、BA.5、BQ.1.18）的灭活材料样本，2个含有两种季节性人类冠状病毒（HCoV-229E和HCoV-OC43）灭活材料的对照样本，以及1个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的阴性对照样本。为了评估灵敏度，样本中还包含了不同浓度的BA.4、BA.5和BQ.1.18。这些变异株的选择代表了EQA进行时的流行变异株。

样本制备、验证和分发

所有SARS-CoV-2样本均从临床样本中分离，使用Vero E6细胞培养。样本通过0.05% β-丙内酯（BPL）灭活，并在4°C下孵育14-16小时，随后在37°C下孵育2小时。灭活后的样本经过三次连续传代，以确认SARS-CoV-2完全灭活。样本稀释至所需浓度后进行冷冻干燥，并以室温运输至各参与实验室。

数据收集

结果通过在线调查表（托管在欧盟调查平台上）报告。参与者需对样本进行评分（阳性、阴性或不确定），并提供循环阈值（ct）值、提取方法以及RT-PCR类型（内部协议和/或商业试剂盒）等信息。此外，参与者还可以报告确定的SARS-CoV-2变异株（WHO标签或Pango谱系）和/或特征突变，以及使用的测序方法。

结果评估

分子检测结果根据以下标准评分：正确报告样本（SARS-CoV-2 RNA的存在或缺失）：0分，不确定结果：1分，假阴性或阳性结果：2分。对于测序结果，根据正确鉴定的变异株/特征突变、一般鉴定为关注变异株（VOC）以及错误分型进行区分。

统计分析

数据清理和分析使用R（版本4.3.0）进行，图表使用GraphPad Prism（版本9.0）或R（版本4.3.0）绘制。

结果

参与情况

31个国家的38个专家实验室报告了EQA结果，覆盖了26个欧盟/欧洲经济区国家和5个欧盟候选国家。

SARS-CoV-2的分子检测

31个实验室（82%）正确分类了所有10个样本，4个实验室（11%）正确分类了9个样本，3个实验室（8%）正确分类了8个或更少的样本。在所有报告的结果中，3%（10/380）是错误的。在含有SARS-CoV-2的样本中，1.1%（3/266）被报告为不确定，1.5%（4/266）被报告为阴性。三个实验室（7.9%；3/38）对一个或两个样本报告了不确定结果。最低浓度（≤70病毒RNA拷贝[ cps]/μL）的三个样本未被一个实验室（2.6%；1/38）报告为阳性。两个实验室对一个样本报告了假阳性结果（5.2%；2/38），其中一个实验室将阴性对照检测为阳性，另一个实验室将含有OC43的样本检测为SARS-CoV-2阳性。

SARS-CoV-2变异株鉴定

13个实验室报告了变异株鉴定结果。其中3个实验室使用分型PCR鉴定变异株，9个实验室进行了测序。样本的测序质量随病毒RNA浓度的增加而提高。对于高浓度样本，69%（9/13）的实验室正确鉴定；而对于最低浓度样本（12和13 cps/μL），只有27%（3/13）和8%（1/13）的实验室正确鉴定。

与前两次欧洲SARS-CoV-2 EQA的比较

参与实验室数量从2020年的68个减少到2023年的38个，平均每个国家的参与实验室数量也从2个减少到1个。在检测方法上，使用商业试剂盒的比例逐渐增加，而使用内部方法或两者结合的比例有所下降。从2020年的12%到2021年的75%，再到2023年的90%，正确识别所有样本的实验室比例显著提高。

讨论

本研究报告了2023年进行的第三次欧洲SARS-CoV-2分子检测EQA的结果，包括变异株鉴定。与前两次EQA相比，参与实验室数量减少，但检测性能有所提高。尽管低浓度样本的检测灵敏度仍存在挑战，但总体而言，欧洲实验室在SARS-CoV-2分子检测和变异株鉴定方面的能力显著提升。未来EQA应更多关注测序能力的提升，以满足日益增长的分子监测需求。

致谢

感谢所有参与EQA的实验室以及为本研究提供支持的ECDC、Charité和RIVM的工作人员。本研究由欧洲疾病预防与控制中心（ECDC）资助。